环境雌激素（Environmental Estrogens, EEs）在极低的剂量水平就具有雌激素活性，且可通过食物链进入人体并在生物体内富集从而对机体产生不利影响。在中国水体污染非常严重，其中雌激素污染也已引起人们广泛关注，但目前尚没有一种高灵敏度检测其综合生物学活性的方法。环境雌激素主要是通过激素受体介导调控靶基因转录表达，从而产生雌激素类效应。本研究利用雌激素受体α（Estrogen Receptor α, ERα）、雌激素受体反应元件(Estrogen Receptor response Element, ERE)和荧光素酶报告基因等，建立了一种用于检测环境雌激素的高灵敏度单克隆稳定转染HeLa细胞株检测系统。研究内容包括：一、根据人雌激素受体α基因完整开放阅读框（ORF）序列设计特异性引物，应用RT-PCR技术从人胎盘组织中扩增到长约为2kb的DNA片段。将其克隆至pEASY-T1载体，测序结果表明成功获得ERα完整ORF，包括1788个核苷酸，编码595个氨基酸残基。将该片段克隆至真核表达载体构建重组质粒pEGFP-ERα，通过PCR、双酶切和测序鉴定表明重组质粒构建成功。将该质粒转染人子宫颈癌（HeLa）细胞，通过G418抗生素筛选获得稳定表达ERα基因的HeLa细胞株，对转染子进行荧光定量PCR鉴定，发现该细胞中ERαmRNA转录水平是阴性对照组的3.45倍，P值分析小于0.05，说明转染子与阴性对照组在ERα mRNA水平存在显著差异，表明ERα基因已稳定存在HeLa细胞中，将该转染子命名为HeLa/ERα。二、将人工合成的一段四倍串联雌激素受体反应元件ERE4基因插入pGL3-basic载体多克隆位点（MCS）上，构建带有雌激素依赖性顺式调控元件ERE4及由ERE4所调控的报告基因荧光素酶基因（luc）的雌激素作用报告载体pGL3-ERE4-luc。经双酶切、测序鉴定构建成功的pGL3-ERE4-luc重组质粒转染HeLa/ERα转染子，利用潮霉素B抗生素压力（Hygromycin B，HygB）持续筛选，体外添加10-3mmol/L17β-雌二醇（E2），应用化学发光仪检测报告基因荧光吸收达到229,000，说明环境雌激素稳定转染HeLa细胞株检测系统构建成功，将含有以上两种重组质粒的单克隆HeLa细胞株命名为HeLa/ERα/ERE4细胞株。三、利用构建成功的稳定转染的HeLa细胞株检测系统对钱塘江杭州段水域和浙江省杭州市下沙高教园区人口密集地生活污水同一时段各取水点进行雌激素污染检测，总取水点为10处，取水样品数为16个，检测出含雌激素污染样品为2个，检测出总雌激素活性(相当于E2)为0.2-0.3ng/L。四、探讨环境雌激素污染对昆虫机体生长发育的影响，利用本实验室家蚕生物反应器为实验平台，以菁松×皓月家蚕品种为实验材料，以含雌激素污染水样为家蚕饲料用水，用于从家蚕孵化至5龄整个生长时期的食物来源。检测5龄蚕血淋巴雌激素含量，与正常水源喂养家蚕5龄蚕血淋巴雌激素含量比较发现过高雌激素（终含量为4×10-3pmol/gs，以10pmol/L E2溶液配制饲料）添加导致家蚕整体生长大小不整齐、部分个体变小、发育变慢，熟蚕不结茧率明显增加，出现死笼情况多等症状，此外，雌二醇终含量为4×10-3pmol/g时，家血淋巴中的雌激素含量反而降低。该方法利用ERE4的调节作用和荧光素酶活性通过两级放大方法，为检测样品中雌激素的综合活性建立了一种高灵敏度高通量的检测方法。