【摘 要】
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目的:本研究旨在建立临床前研究的药物性肝损伤模型,在临床前期研究水平评价老鼠簕生物碱A（HBOA）对药物性肝损伤的作用效果,为老鼠簕生物碱A的进一步开发和利用提供实验依据。方法:随机分60只雄性昆明小鼠为正常组、APAP组（对乙酰氨基酚300mg/kg）、HBOA高、中、低剂量组（200、100、50 mg/kg）和阳性组（联苯双酯150 mg/kg）。灌胃给予HBOA高、中、低剂量组和阳性组相对
【基金项目】
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项目名称:基于TGF-β/Smads通路及ADAMTS-2蛋白表达对老鼠簕生物碱A抗肝纤维化作用机制的研究,项目合同编号:81660106,项目来源:国家自然科学基金,项目起止时间:2017年01月-2020年12月
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目的:本研究旨在建立临床前研究的药物性肝损伤模型,在临床前期研究水平评价老鼠簕生物碱A（HBOA）对药物性肝损伤的作用效果,为老鼠簕生物碱A的进一步开发和利用提供实验依据。方法:随机分60只雄性昆明小鼠为正常组、APAP组（对乙酰氨基酚300mg/kg）、HBOA高、中、低剂量组（200、100、50 mg/kg）和阳性组（联苯双酯150 mg/kg）。灌胃给予HBOA高、中、低剂量组和阳性组相对应的实验试剂,正常组与APAP组则灌胃给予等量的配置好的羧甲基纤维素钠溶液,每天一次,总共持续灌胃十天。灌胃给药结束之后,HBOA高、中、低剂量组和阳性组腹腔注射300mg/kg对乙酰氨基酚,模拟临床上药物性肝损伤的模型。小鼠取材完毕后,用苏木素-伊红染色法检测肝脏组织的病理变化;原位末端转移酶标记技术法检测肝细胞凋亡情况;全自动生化分析仪检测血清中AST、ALT与TBIL的含量;试剂盒测定肝组织中GSH、GSH-PX、CAT、SOD、MDA及ROS的含量。蛋白免疫印迹法测定IκBα、p-IκBα、NF-κBp65、p-NF-κBp65、IKKα/β、p-IKKα/β、NF-κBp50、HO-1、Keap1、Nrf2、Bax、Bcl-2、Cyt C蛋白表达;RT-PCR法检测HO-1、NQO1、GCLC、GCLM、MGST-1 m RNA的表达。结果:1.HBOA对药物性肝损伤具有一定的减缓作用针对此次实验,较于正常组,APAP组小鼠血清中AST、ALT、TBIL水平显著上升（P<0.05）;苏木素-伊红染色的结果显示APAP组的肝细胞均具有明显的变性坏死现象,说明药物性肝损伤模型已被成功复制。各给药组对比APAP组,该小鼠血清AST、ALT、TBIL的表达含量呈现出下降的趋势（P<0.05）;且其苏木精-伊红染色结果中肝细胞变性坏死状况减轻。这些结果均能说明HBOA对药物性肝损伤具有一定的缓解作用。2.HBOA能够增强药物性肝损伤中的抗氧化能力经试剂盒检测相关抗氧化酶得到结果,APAP组的小鼠肝组织与正常组相比较,其MDA与ROS的组织含量显然是升高的,GSH-PX、GSH、CAT、SOD则表达水平较低（P<0.05）;HBOA各给药剂量组较于APAP组,该肝组织的MDA与ROS表达含量降低,而GSH-PX、GSH、CAT及SOD的表达水平则是升高的趋势（P<0.05）。以上结果表明HBOA可以增强药物性肝损伤中抗氧化酶的表达。3.HBOA能够减弱药物性肝损伤中肝细胞凋亡与线粒体损伤状态原位末端转移酶标记技术（TUNEL）细胞凋亡试剂盒检测小鼠肝细胞的凋亡情况。APAP组对比于正常组小鼠的肝细胞存在大量的凋亡现象;相较于APAP组,HBOA各给药剂量组中细胞凋亡情况减少。由蛋白免疫印迹法测定肝组织中Bcl-2与Bax蛋白以及胞浆中的Cyt C蛋白表达水平。与APAP组比较,HBOA各给药剂量组降低Bax与Cyt C的蛋白表达（P<0.05）,升高Bcl-2的蛋白表达（P<0.05）。由上述结果可得,HBOA调控Bcl-2家族蛋白与Cyt C蛋白的表达,改善药物性肝损伤产生的肝细胞凋亡与线粒体损伤。4.HBOA能够抑制药物性肝损伤中NF-κB信号通路的过表达为探讨HBOA在过量APAP刺激小鼠肝损伤过程中对NF-κB信号通路的影响,我们检测了NF-κB通路相关蛋白的表达水平,包括IκBα、p-IκBα、NF-κBp65、p-NF-κBp65、IKKα/β、p-IKKα/β及NF-κBp50。小鼠肝组织蛋白免疫印迹结果比较,APAP组对于正常组来说,其NF-κBp50、p-IκBα、p-NF-κBp65及p-IKKα/β蛋白表达明显增加（P<0.05）;对比APAP组,HBOA各给药剂量组的蛋白p-IκBα、p-NF-κBp65、p-IKKα/β和NF-κBp50表达减少（P<0.05）。结果阐明了HBOA对NF-κB信号通路的表达具有抑制作用。5.HBOA能够促进药物性肝损伤中Nrf2信号通路的表达经蛋白免疫印迹法检测得,APAP组小鼠的肝组织蛋白中HO-1、Keap1及Nrf2的表达比正常组低（P<0.05）;HBOA各给药剂量组的HO-1、Keap1及Nrf2的表达对比APAP组则有所升高（P<0.05）。由RT-PCR实验结果可知,APAP组对比于正常组,肝组织中的Nrf2下游HO-1、NQO1、GCLC、GCLM、MGST-1 m RNA的表达降低（P<0.05）,HBOA各给药剂量组较于APAP组,其Nrf2信号通路下游的相应基因的表达含量显著增多（P<0.05）。这些结果表明了在药物性肝损伤中,HBOA对Nrf2通路的表达起到了促进作用。结论:老鼠生物碱A对药物性肝损伤具有一定的缓解作用,其可能是与降低小鼠血清中异常升高的肝功能酶水平,增强抗氧化酶的作用,减弱肝细胞的凋亡与线粒体的损伤,促进Nrf2信号通路及抑制NF-κB信号通路的表达有关,从而达到保护肝脏的目的。
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