论文部分内容阅读
环境中存在多种多样的可降解利用纤维素的微生物。我们可以筛选获得具有高效纤维素酶的细菌或真菌，以应用于纤维素的分解与利用，克服当前生物燃料的挑战。本论文从土壤中分离到两株产β-1，4-内切葡聚糖酶的Bacillus sp.RL1和RL2。用16S rDNA比对的序列构建系统树表明它们属于革兰氏阳性细菌芽孢杆菌。芽孢杆菌RL1、RL2的16S全长1513bp，其G+C含量分别为53.46％和53.6％。对这两种酶进行纯化，其分子量分别为30kDa、27kDa，等电点为6.5、8.15。RL1的β-1，4-内切葡聚糖酶的开放阅读框有822bp，编码273个氨基酸，RL2的β-1，4-内切葡聚糖酶的开放阅读框有723bp，编码240个氨基酸。EgI-RL1与B.thuringiensis serovar berliner ATCC10792,B.cereus m1550,B.thuringiensis serovar pakistani str有100％的同源性，EgI-RL2的氨基酸序列与B.cereus m1550，B.cereus ATCC4342有99％的同源性、与B.cereus MM3和B.pseudomycoides DSM 12442有97％的同源性。用PCR方法扩增RL1、RL2的全长基因（EgI-RL1、EgI-RL2），分别为1400bp、l500bp。EgI-RL1、EgI-RL2基因的酵母表达:与有EcoR1和Not(1)酶切位点的pPIC9K载体连接，产生的两个质粒pPIC9K-EgI-RL1和pPIC9K-EgI-RL2用saI(1)线性化，然后转到毕赤酵母中。上述的结果表明Bacillus sp.RL1和Bacillus sp.RL2的基因EgI-RL1与EgI-RL2属于糖苷水解酶家族8。
两个内切葡聚糖酶的最适pH都是7.0，最适温度为35℃，EGBRL1与EGBRL2在pH4-10之间都有很好的稳定性，很多芽孢杆菌内切葡聚糖酶都有范围较广的pH稳定性，这种特性可使酶更好的用在碱性环境比如造纸工程。EGBRL1有很好的热稳定性:在90℃处理30min后，仍保留最初活性的85.5％，EGBRL2在90℃处理30min后保留90.3％的酶活性。淀粉和菠萝皮是最好的碳源，最好的氮源酵母膏和胰蛋白胨，以结晶状的纤维素比如滤纸为碳源也有明显的活性。RL1和RL2内切葡聚糖酶的Km分别为0.2797 mg ml-1、0.0947 mg ml-1, Vmax分别为0.2124 mmol glucose min-1 mg protein-1、0.1646 mmol glucose min-1 mg protein(-)1，Fe2+、Co2+能够显著提高EGBRL1的活性(分别为275％和157％)。