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神经肽B(Neuropeptide B,NPB)是2002年从牛的下丘脑中提取的一种神经肽,因其是第一个被发现澳化的神经肽,故命名为神经肽B。NPB有两种形式,NPB23和NPB29,但是在哺乳动物中只在人上发现NPB23的存在。神经肽W(Neuropeptide W)是2002年Shimomura从猪下丘脑中分离的一种神经肽,由于其第一个和最后一个氨基酸为色氨酸(Trp,缩写为W),故命名为神经肽W,NPW有NPW23和NPW30两种形式,分别含有23和30个氦基酸。NPW和NPB是G蛋白藕联受体GPR7和GPR8的内源性配体,这两种受体被重新命名为NPBWR1和NPBWR2。以往的文献报道证实,NPB和NPBWR1在哺乳动物动物体内广泛分布,参与摄食、神经内分泌、生殖、炎性疼痛和情绪等多种生理功能的调节。自NPB被发现以来,在人、鼠已有过大量对其基因结构、分布定位及生理功能的研究,但尚未见到在猪上的研究报道。因此,本文以猪为研究对象,采用电子克隆、RT-PCR、QPCR、免疫组化和放射免疫等方法,克隆了猪NPB及其受体的基因,研究其mRNAs在组织器官中的表达,NPBWR1和NPBWR2在猪卵巢颗粒细胞和睾丸间质细胞的分布以及NPB和NPW对这两种细胞增殖和激素分泌的影响,为深入研究NPB和NPW对猪生殖调控奠定了基础。一、猪NPB和NPBWR1的基因克隆和组织表达本实验采用电子克隆的方法克隆了猪NPB和NPBWR1的基因序列并进行了生物信息学的分析,通过QPCR的方法研究了其mRNAs在猪全身各组织器官的表达情况。结果如下:1、本次克隆得到猪NPB和NPBWR1的全长序列,片段大小分别是372 bp、993 bp。猪NPB和NPBWR1基因与其他物种在核苷酸和氨基酸水平均具有较高的同源性。2、NPB及其受体NPBWR1 mRNAs在猪中枢神经系统和外周组织器官广泛分布。二、NPBWR1和NPBWR2在猪生殖相关细胞的表达与分布本实验采用RT-PCR和免疫组化的方法研究了 NPB受体在卵巢颗粒细胞和睾丸间质细胞的表达和分布,结果如下:1、NPBWR1和NPBWR2mRNAs在猪生殖相关细胞上均有表达。2、通过细胞免疫组化和免疫荧光的方法证实NPBWR1在猪卵巢颗粒细胞和睾丸间质细胞膜上均有分布。三、NPB和NPW对原代培养的猪生殖相关细胞增殖和激素分泌的影响不同浓度的NPB和NPW(10-12、10-10、10-8、10-6M)均可促进睾丸间质细胞睾酮的分泌,并呈浓度依赖性。不同浓度的NPB和NPW均可剂量依赖性的促进卵巢颗粒细胞孕酮的分泌。低浓度的NPB和NPW(10-8、10-10M)促进雌二醇的分泌,高浓度的NPB和NPW(10-6M)抑制雌二醇的分泌。NPB和NPW对睾丸间质细胞有促进增殖的作用。