副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是引起人类胃肠炎的主要食源性致病菌。作为一种重要的肠道病原体,副溶血性弧菌必须克服多种宿主因子的挑战才能成功定殖于人体胃肠道并引起胃肠炎。胆汁是挑战之一,它对人体的消化和营养吸收至关重要,并且胆汁具有的杀菌特性有助于预防肠道病原体定殖。然而,副溶血性弧菌等肠道致病菌不仅进化出了对胆汁杀菌特性的抵抗能力,而且还可以利用胆汁作为信号来调节毒力基因的表达,从而在胃肠道中定殖或维持感染。引起大流行性疾病的神奈川现象(KP)阳性副溶血性弧菌含有一个致病岛(Vp-PAI),岛中包含两个tdh基因和一个III型分泌系统(T3SS2),在Vp-PAI中存在一个新型Tox R样转录调节蛋白Vtr B。在副溶血性弧菌等肠道病原体感染宿主期间,转录调节子Tox R对于调节毒力和持久性至关重要,并且与胆汁抵抗有关。Vtr B与Tox R的N末端具有同源性,仅在胆汁存在时被诱导,进而增强副溶血性弧菌TDH和T3SS2介导的细胞毒性和肠毒性。因此,Vtr B被认为是胆汁诱导的Vp-PAI中毒力基因表达的关键调控因子。然而作为胆汁依赖性转录调节蛋白,Vtr B在副溶血性弧菌抵抗胆汁中的作用以及在胆汁诱导下对毒力基因的整体调控功能还不明确。因此,为了探讨Vtr B是否有助于tdh~+(KP+)副溶血性弧菌在胆汁中的存活以及Vtr B在其抵抗胆汁中的作用,同时充分了解Vtr B作为副溶血性弧菌毒力调节因子响应于胆汁刺激后的整体调控功能(即对Vp-PAI及Vp-PAI之外基因的调控)。本研究首先筛选含有vtr B基因的副溶血性弧菌,然后构建vtr B基因突变株与回补株;通过胆汁对WT、Δvtr B与C-Δvtr B菌株的MBC、MIC和胆汁诱导的三株菌的运动能力和生物膜形成能力分析胆汁对Δvtr B突变株的影响;最后通过胆汁诱导的WT和Δvtr B菌株转录组学分析来确定在胆汁诱导下vtr B基因的整体调控网络。本研究主要结果如下:1.利用副溶血性弧菌RIMD2210633中VPA1348(vtr B)基因的核苷酸序列设计引物后通过PCR扩增显示从10株tdh~+trh~-副溶血性弧菌中筛选得到vtr B基因,经测序比对后匹配率高达99%。随后通过自杀载体同源重组的方法成功构建副溶血性弧菌无痕突变株Δvtr B;以p BAD33质粒为载体构建vtr B::p BAD33重组质粒,并将重组质粒电转入Δvtr B突变株中,获得副溶血性弧菌vtr B基因回补株C-Δvtr B。2.胆汁对Δvtr B突变株的MBC、MIC分别为12.5%和2%,均低于WT菌株(15%和2.5%),且vtr B基因的回补恢复了胆汁对其的MBC与MIC,Vtr B可以提高副溶血性弧菌Vp6-Sm~r在胆汁中的存活。与WT和C-Δvtr B菌株相比,在含有胆汁的泳动、群集和蹭行平板上,Δvtr B突变株的泳动、群集和蹭行直径显著增加(P<0.05)。经0.04%胆汁诱导后的Δvtr B突变株在24 h形成的总生物膜量比野生株大约2倍,表现出比野生型菌株更强的生物膜形成能力(P<0.05),在胆汁诱导下Vtr B能够抑制副溶血性弧菌运动能力和生物膜的形成。3.利用RNA-seq技术对经0.04%胆汁诱导的WT和Δvtr B菌株进行转录组测序。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)随机分析了12个差异调节基因的转录水平证实了RNA-seq结果的可靠性。在Δvtr B突变株中共有701个基因差异表达,其中462个基因上调,239个基因下调。副溶血性弧菌在缺少vtr B基因的情况下,45个位于Vp-PAI内的基因显著下调(包括tdh和T3SS2相关基因)。除了Vp-PAI致病岛上的基因发生差异表达外,Vp-PAI致病岛外的基因也发生了差异表达,占总差异基因表达的69%。其中包括3%的T3SS1分泌系统基因、14%的T6SS分泌系统基因、24%的鞭毛和趋化性相关基因、7%的生物膜形成基因和16%的转录调控因子和编码与环境适应性相关蛋白的基因等。4.在胆汁诱导下,18个T6SS2的基因在Δvtr B突变株中显著上调,表明Vtr B是副溶血性弧菌T6SS2的负调节子。在肠道感染过程中,Vtr B可能通过抑制Hcp2和Vgr G2等的表达增强副溶血弧菌对胆汁的抵抗能力从而有利于其随后的存活。相反,三个T6SS1相关的基因—VP1409、VP1410基因和编码VI型分泌脂蛋的vas D基因被vtr B基因诱导。表明Vtr B能够以胆汁依赖性方式诱导T6SS1介导的副溶血性弧菌环境竞争力,促进副溶血性弧菌在肠道环境中存活。5.在运动性方面,参与极性鞭毛生物合成的fla C,flg H,fli GO和flh A基因,参与侧鞭毛生物合成的fli SD,flg JL和mot B基因以及编码蹭行性运动蛋白,Sigma-54依赖性转录调节子和甲基接受趋化蛋白的基因在Δvtr B突变株中显著上调。表明Vtr B是副溶血性弧菌鞭毛生物合成和趋化性的负调节子。在胆汁存在下,Vtr B能够抑制副溶血性弧菌的运动能力。并且由于鞭毛组装和/或趋化性拮抗T3SS,被Vtr B抑制的运动能力也可能与Vtr B诱导的T3SS2和T3SS1相关基因的表达增加有关。此外,5个编码参与生物膜形成的GGDEF家族蛋白的基因的转录水平也显著上调,表明Vtr B可能在胆汁的存在下通过抑制GGDEF家族蛋白的表达介导生物膜的分散。6.同时响应于胆汁,与副溶血性弧菌环境适应性和定殖相关的基因也发生了差异表达。Δvtr B突变株中与副溶血性弧菌酸耐受相关的cad A和cad B基因以及编码热休克蛋白和Csp A的基因的表达水平显示下调,表明Vtr B在除了有助于副溶血性弧菌抵抗胆汁外,也可能诱导其对其他环境的适应性,例如酸,热和冷胁迫。辅助定植因子Acf A也显示出明显的下调,表明在感染期间,Vtr B可能会通过诱导Acf A的表达来促进副溶血性弧菌在宿主肠道内的定殖。综上,本研究表明Vtr B有助于副溶血性弧菌胆汁抵抗,并且可以在Vp-PAI岛外行使转录控制以协调毒力基因表达来帮助副溶血性弧菌成功感染宿主的胃肠道。