研究背景及目的食管癌是一种全球范围内常见的恶性肿瘤,发病率和死亡位居所有恶性肿瘤的第7位和第6位。食管癌可以分成两种常见的病理类型,即食管鳞状细胞癌和食管腺癌,我国亦是食管癌的发病大国,2015年全国食管癌估计新发病例约24.57万例,发病率位于恶性肿瘤的第6位,估计死亡病例为18.81万例,位居第4位,均高于全球平均水平。目前食管癌的方式主要有赖于以手术结合放化疗等治疗的综合治疗,但由于食管不含浆膜层,而食管外膜又是由疏松的纤维组织构成且与纵隔胸膜关系紧密的这一解剖学特点,食管癌更容易发生纵隔淋巴结的转移以及远处转移,且加上食管癌早期并无明显症状,往往食管癌患者在被确诊时肿瘤已经进展至晚期,丧失了手术机会,传统的治疗方式效果欠佳。而在近年来医学水平不断发展,食管癌诊疗水平获得长足进步的背景下,据统计过去十余年我国食管癌的5年生存率从约20%已经升高至30%左右,但总体预后仍不理想。根据官方数据,我国86.3%的食管癌病例为食管鳞癌,食管鳞癌和食管腺癌从生物学特征上来说实际上是两种不同的疾病。但目前为止他们的治疗方案大致相同,通常取决于肿瘤处于何种分期。近年来恶性肿瘤分子靶向和免疫治疗研究方兴未艾,因其迅猛发展所取得的良好效果,更有必要将两者从分子生物特征上区分开从而实施更精准更具针对性的治疗。FOX家族,被称之为叉头框蛋白(Forkhead box),其特征是具有一段长度为110个氨基酸,高度保守的且和果蝇叉头基因相应区域高度同源的DNA结合域。根据叉头框的序列可进一步分为从FOXA到FOXS 19个亚族。而FOXA家族成员被认为是内胚层形成以及相关器官如肝脏、胰腺、肺和前列腺等的正常发育所必需的,还可以通过调节肝脏,胰腺和脂肪组织中的多个靶基因来调控能量代谢从而参与了许多疾病的发生发展,更是与恶性肿瘤的发生、发展以及转移等各个环节息息相关。FOXA亚族具体可分为为FOXA1、FOXA2、FOXA3三个成员,目前关于FOXA1及FOXA2研究较多,而截至目前,针对FOXA3的研究较少,关于FOXA3的研究仍多聚焦在细胞分化、器官形成、能量代谢、肝再生以及肝细胞重编程的领域。最近有研究发现FOXA3可以增加靶向药物索拉菲尼在肝癌治疗中的敏感性。并且发现FOXA3在肝癌组织中、转移灶和复发灶中表达明显下降,FOXA3低表达是肝癌患者不良预后的独立危险因素。并且上调FOXA3表达后能够促进肝癌干细胞和肝癌细胞分化,抑制肝癌细胞生长。另外最近有一项研究分析了各公共数据库的数据,发现FOXA3在肺癌组织及细胞株中高表达,并且认为其与患者较差的预后相关。尽管FOXA3在食管鳞癌中的表达和作用不甚明确,但基于上述FOXA3在癌症研究的成果,加之FOXAl和FOXA2在食管鳞癌、腺癌以及Barrett食管的发生、发展均发挥了一定作用,因此我们推测FOXA3极有可能与食管鳞癌发病的各个环节密切相关。本课题首先拟检测食管鳞癌中FOXA3的表达情况,并分析FOXA3与食管鳞癌患者临床病理资料以及预后的相关性;再通过相关一系列的体内体外实验探究FOXA3在食管鳞癌的增殖、侵袭迁移中的作用,主要分为以下两个部分:第一部分:食管鳞癌中FOXA3表达水平与临床病理资料的相关性目的:研究FOXA3在食管鳞癌中表达和患者临床病理资料及预后的关系研究方法:首先收集了在海军军医大学长征医院接受手术治疗的11例食管鳞状细胞癌和对应的癌旁新鲜组织,并采用Real-time PCR方法检测其FOXA3 m RNA的表达水平,随后采用免疫组织化学染色方法检测了93例食管鳞状细胞癌和对应的癌旁组织石蜡切片FOXA3表达水平并结合这93例患者的临床资料分析两者的相关性;随后根据患者术后随访结果,利用COX回归方法分析FOXA3表达与食管鳞癌患者预后的关系,并利用Kaplan-Meier生存曲线分析FOXA3的表达对食管鳞癌患者总体生存率的影响。结果:食管鳞癌中FOXA3的表达较癌旁组织显著降低,并且在食管鳞癌中FOXA3低表达与淋巴结是否存在转移密切相关(P=0.002)。FOXA3低表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分化程度以及肿瘤浸润程度均无明显相关性。通过对患者术后的随访,我们发现FOXA3低表达患者总体生存率相对高表达患者明显降低(P=0.001)。COX回归分析表明FOXA3低表达是影响食管鳞癌患者预后的独立危险因素(P=0.032)。结论:食管鳞癌组织中FOXA3表达明显下降,并且其低表达与食管鳞癌患者是否存在淋巴结转移密切相关,并且是患者预后不良的独立危险因素。第二部分:FOXA3在食管鳞癌增殖以及侵袭转移的影响目的:探究FOXA3在食管鳞癌细胞增殖以及侵袭迁移中的作用研究方法:1.构建特异性上调FOXA3表达的慢病毒载体,在FOXA3表达较低的食管癌细胞系TE-1及Eca-109中建立稳定表达的FOXA3上调组(Ad-FOXA3),同时使用空白载体转染细胞建立对照组(Ad-Con)。采用Real-time PCR方法以及Western-Blot检测干扰组和对照组FOXA3 m RNA和蛋白质的表达,确保干扰有效。2.体外实验中,对Ad-FOXA3和Ad-Con组TE-1及Eca-109细胞系进行CCK-8检测、Ed U检测以及平板克隆实验检测两组细胞增殖能力的变化;进行划痕实验以及Transwell实验检测两组细胞侵袭迁移能力的变化。3.体内实验采用食管鳞癌细胞裸鼠皮下成瘤的方法,实验组注射转染后的Ad-FOXA3组Eca-109细胞,对照组注射Ad-Con Eca-109细胞,接种六周后处死小鼠后,剥离肿瘤进行重量检测FOXA3表达高低在体外对食管鳞癌细胞增殖的影响。结果:1.建立了上调FOXA3表达的食管鳞癌细胞系TE-1和Eca-109,结果显示FOXA3上调组在慢病毒转染后FOXA3 m RNA表达量较对照组明显增加。2.体外实验中,CCK-8检测、Ed U检测以及平板克隆实验均发现上调FOXA3表达后食管鳞癌细胞增殖能力明显下降;划痕实验以及Transwell实验均发现上调FOXA3能够明显抑制食管鳞癌细胞的侵袭迁移能力。3.体内实验中通过裸鼠皮下成瘤的方法发现FOXA3上调后肿瘤大小明显小于对照组,提示FOXA3在体内亦具备抑制肿瘤增殖生长的作用。结论:在食管鳞癌细胞系中上调FOXA3表达后,食管鳞癌细胞的增殖能力以及侵袭迁移能力均明显下降。全文结论FOXA3在食管鳞癌组织中的表达显著降低,并且在食管鳞癌患者中FOXA3的低表达与淋巴结是否存在转移密切相关,同时也是食管鳞癌患者预后不良的独立危险因素。体内外实验显示在食管鳞癌细胞系中上调FOXA3表达能够明显抑制食管鳞癌细胞的增殖能力以及侵袭迁移的能力。通过以上研究,我们得出初步结论:FOXA3可能作为一种抑癌基因,可以抑制食管鳞癌细胞的增殖、侵袭迁移等过程。在下一步的研究中,需要构建肿瘤转移的动物模型进一步明确FOXA3在体内对肿瘤转移的作用,并就FOXA3究竟是如何参与到肿瘤的增殖、侵袭和转移过程中的机制进行研究。FOXA3有望成为食管鳞癌早期诊断的分子标志、预后判断的有效指标以及分子靶向治疗的关键靶点,亟待下一步更深入地研究。