甘蔗黑穗病是由黑粉菌(Sporisorium scitamineum)引起的一种气传真菌性病害，已经成为世界各植蔗区的主要病害之一。甘蔗黑穗病能引起蔗茎产量降低和蔗糖分的减少，给甘蔗产业造成较为严重的损失。杂交育种是甘蔗抗黑穗病育种最主要也是最重要的途径，但是，由于甘蔗抗黑穗病基因大多来源于野生种，而野生种中高产高糖基因与一些不利基因存在紧密连锁的关系，使得甘蔗传统杂交育种在导入抗病基因的同时，也导入了一些不良的非目标性状基因。因此，如果能在解析甘蔗与黑穗病菌互作的分子机理的基础上，挖掘抗病关键基因，进而通过转基因手段将此类基因转导入目标甘蔗品种中，达到定向改良品种抗性的目的，既可以避免不良性状基因的导入，又能保持目标甘蔗品种原有的优良性状和品质特性，同时兼具抗黑穗病的特性，是解决甘蔗抗黑穗病育种瓶颈的一种有效途径。本研究以甘蔗品种新台糖22号(ROC22)为实验材料，首先，使用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)技术构建cDNA文库；其次，利用反向Northern杂交技术，筛选差异表达基因；再次，通过电子克隆和RT-PCR相结合的技术，克隆目的基因；最后，在对所克隆基因进行生物信息学分析的基础上，利用实时荧光定量PCR技术，检测这些基因的组织特异性表达情况以及在黑穗病菌、SA(salicylic acid)、MeJA(methyl-jasmonate)和ABA(abscisic acid)胁迫下的表达特性，以期揭示这些候选基因在甘蔗对黑穗病抗性中的作用机制，为后续利用甘蔗基因工程手段定向改良甘蔗品种对黑穗病的抗性，提供具有自主知识产权的基因资源，课题研究具有较为重要的理论和实践意义。主要实验结果如下：　　1、以接种甘蔗黑穗病菌48h和接种无菌水48h时间点的蔗芽为材料，利用抑制消减杂交技术，构建黑穗病菌胁迫下的甘蔗正、反向SSH文库。随后从文库中随机挑取24个克隆进行PCR鉴定，结果显示插入片段长度主要分布于150～750bp之间，说明本研究构建的SSH文库质量良好。　　2、从SSH文库中，筛选768个阳性克隆，进行反向Northern杂交，经过分析杂交信号强度，筛选获得190个差异表达基因。　　3、对经反向Northern杂交验证到的190个阳性克隆进行测序及生物信息分析，去除重复、污染及低质量(<100bp)序列后，获得了174个差异表达基因，这些基因主要存在于高分子配体(macromolecular complex)或细胞器(organelle)中，具有催化活性(catalytic activity)和结构分子活性(structural molecule activity)，参与糖酵解(Glycolysis/Gluconeogenesis)、光合作物固碳(Carbon fixation in photosynthetic organisms)、半胱氨酸和蛋氨酸代谢(Cysteine and methionine metabolism)、二羧酸代谢(Glyoxylate and dicarboxylate metabolism)、氨基糖和核苷酸糖代谢(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)等代谢途径。　　4、在差异表达基因测序及生物信息学分析的基础上，开展如下工作：　　首先，从SSH文库中挑选6个差异表达EST序列，经电子克隆和RT-PCR扩增验证获得6个差异表达基因的全长cDNA序列，分别命名为细胞色素b5还原酶基因(Scb5R，GenBank登录号：KJ577591)、14-3-3蛋白基因(Sc14-3-3，GenBank登录号：KJ577592)、乙醇脱氢酶基因(ScADH，GenBank登录号：KJ577593)、泛素结合酶基因(ScUBc E2，GenBank登录号：KJ577594)、真核翻译起始因子5A基因(SceIF5A，GenBank登录号：KJ577595)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(ScSAM，GenBank登录号：KJ577596)；　　其次，对这6个基因进行生物信息学分析：甘蔗Scb5R基因全长1257bp，ORF长840bp，编码氨基酸297个，编码蛋白是一种无信号肽，定位于内质网的稳定、亲水、碱性、非分泌蛋白，蛋白质二级结构主要为无规则卷曲，主要功能为转运结合；甘蔗Sc14-3-3基因全长1048bp，ORF长771bp，编码氨基酸256个，编码蛋白是一种无信号肽，定位于细胞质的稳定、亲水、酸性、非分泌蛋白，蛋白质二级结构主要为α-螺旋，主要功能为翻译和能量代谢；甘蔗ScADH基因全长1644bp，ORF长1140bp，编码氨基酸379个，编码蛋白是一种无信号肽，定位于叶绿体基质的稳定、亲水、酸性、非分泌蛋白，蛋白质二级结构主要为无规则卷曲，主要功能为能量代谢和翻译；甘蔗ScUBc E2基因全长997bp，ORF长447bp，编码氨基酸148个，编码一种无信号肽，定位于细胞质的不稳定、亲水、碱性、非分泌蛋白，蛋白质二级结构主要为无规则卷曲；甘蔗SceIF5A基因全长1174bp，ORF长483bp，编码氨基酸160个，编码蛋白是一种无信号肽，定位于细胞质的稳定、亲水、酸性、非分泌蛋白，蛋白质二级结构主要为无规则卷曲，主要功能为翻译和能量代谢；甘蔗ScSAM基因全长1788bp，ORF长1196bp，编码氨基酸396个，是一种无信号肽，定位于细胞质的稳定、亲水、酸性、非分泌蛋白，蛋白质二级结构主要为无规则卷曲，主要功能为能量代谢和翻译。　　最后，通过实时荧光定量PCR技术，对这6个基因在叶片、侧芽、蔗髓和根等不同组织中的表达情况及其在黑穗病菌、SA、MeJA和ABA胁迫下的表达特征进行分析，结果显示：这6个基因的转录本，除甘蔗Sc14-3-3基因、ScADH基因外，其余均在侧芽中检测到最高的转录水平。在品种YC05-179中，甘蔗Scb5R基因在受黑穗病菌胁迫及SA、MeJA和ABA诱导后表达均呈“扬-抑-扬”的趋势；甘蔗Sc14-3-3基因的表达受到黑穗病菌、SA、MeJA和ABA强烈诱导表达；甘蔗ScADH基因受ABA诱导表达，同时受黑穗病菌先抑制后诱导表达，SA和MeJA先诱导后抑制表达；甘蔗ScUBc E2基因受SA和MeJA诱导表达。甘蔗SceIF5A基因受黑穗病菌、SA、MeJA和ABA诱导表达；甘蔗ScSAM基因在接种黑穗病菌后呈“扬-抑-扬”表达趋势，受SA诱导后，呈“扬-抑”趋势。