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MicroRNAs(miRNAs)是一类在生物体内长度约为22 nt的内源性非编码RNA,通过转录后调控方式参与调节多种生命活动。飞蝗是世界性的重要农业害虫,表皮周而复始的合成与降解对其正常蜕皮发育起着重要作用。飞蝗表皮几丁质的代谢是一个复杂的生物学过程,几丁质的合成和降解过程主要由几丁质合成酶和几丁质酶等关键酶精确调控。本课题组前期研究已表明几丁质代谢酶—几丁质合成酶1(Chitin Synthase 1,CHS1)和几丁质酶10(Chitinase 10,CHT10)的精确表达在蜕皮发育中起关键作用;同时,我们的研究发现飞蝗miRNA合成通路中LmDicer1基因沉默抑制了成熟体miRNAs的合成,并导致蝗虫蜕皮异常而死亡。由此我们提出科学假设:飞蝗miRNAs可能参与调控表皮代谢关键基因,从而影响昆虫正常蜕皮发育。本文以重要农业害虫飞蝗为研究对象,研究了飞蝗LmDicer1和LmAGO1在mi RNA合成中的作用,更新了飞蝗miRNAs文库并揭示了miRNA对飞蝗表皮代谢基因的调控机制。主要内容如下:1、飞蝗小RNA文库的构建及miRNAs的鉴定通过高通量测序和实验验证,我们鉴定获得833个飞蝗miRNAs。发现随着飞蝗基因组的扩张其体内miRNA也相应增多,其中多个miRNAs是飞蝗特异的。采用RNAi技术干扰miRNA合成通路上的关键基因Drosha,并对其miRNA进行高通量测序,与对照组(dsGFP)相比进一步证明了miRNA库的真实性,飞蝗miRNA的鉴定研究为揭示miRNA在飞蝗体内的生物学功能奠定了基础。2、LmDicer1对miRNA合成及飞蝗蜕皮发育的影响为了阐明飞蝗miRNA合成通路中的关键因子Dicer1在miRNA合成中的作用及对飞蝗生命活动的影响,我们采用RNA干扰(RNAi)及荧光定量PCR(RT-qPCR)等技术分析LmDicer1的表达特性及对飞蝗体内miRNA合成的影响。结果表明:干扰LmDicer1可抑制飞蝗miRNA的合成,从而对飞蝗的蜕皮发育产生影响,导致飞蝗蜕皮异常而死亡。3、Argonaute 1在miRNA合成和飞蝗发育中的作用为了阐明miRNA合成通路中的关键因子Argonaute 1(AGO1)在miRNA形成中的作用,我们采用RNA干扰(RNAi)和荧光定量PCR(RT-qPCR)等技术分析LmAGO1的表达及对体内miRNA形成的影响。发现飞蝗AGO1蛋白不仅可以与miRNA形成RISC复合体指导miRNA与靶标基因结合,而且具有核酸内切酶的作用,参与体内成熟体miRNA的合成与表达,影响飞蝗正常生长发育。4、miRNAs对飞蝗表皮几丁质合成酶和降解酶基因的调控我们进一步研究了miRNAs在飞蝗蜕皮发育过程中的功能。利用生物信息学方法预测得到miR-71和miR-263分别与飞蝗CHS1和CHT10有结合位点;通过RT-qPCR检测发现miR-71和miR-263与LmCHS1和LmCHT10的表达呈负相关关系;利用体外荧光素酶实验和RNA免疫共沉淀(RIP)实验分析发现miR-71和miR-263分别与LmCHS1和LmCHT10有直接相互作用;通过体内显微注射miR-71/mi R-263的激动剂和抑制剂,发现在体内过表达或者沉默miR-71/miR-263,与对照组相比飞蝗因蜕皮困难而死亡。研究结果表明飞蝗miR-71和miR-263分别通过调控LmCHS1和LmCHT10的表达影响新表皮几丁质的合成和旧表皮几丁质的降解,导致飞蝗蜕皮异常而死亡。5、miRNAs对飞蝗表皮代谢基因的调控为了探究miRNAs是否对其他表皮代谢关键基因有调控作用,我们进一步选取了参与表皮代谢的关键基因:脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-N-acetylglucosamine pyrophorylase,UAP)、糖基转移酶(asparagine-linked glycosylation protein 5,ALG5)和Sinuous,通过生物信息学方法预测了与这些关键基因结合的潜在miRNAs,并通过RT-qPCR、体外免疫共沉淀(RIP)、体外荧光素酶等实验验证了表皮代谢基因与miRNAs之间的相互作用关系。结果表明与4个关键表皮代谢基因UAP、ALG5、FAS、和Sinuous潜在结合的miRNAs分别是miRNA-2796、miRNA-275、miRNA-276b和miRNA-184,而且这些miRNAs分别与4个表皮代谢基因之间有相互作用,可能调控了其靶标基因的表达。综上所述,本文系统阐明了飞蝗miRNAs的合成、鉴定并揭示了miRNAs在蜕皮发育中对表皮代谢相关基因的分子调控机制,研究结果将为筛选飞蝗防治中潜在的小分子靶标,设计环境友好型的绿色药物提供重要的科学依据。