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绒山羊次级毛囊的生长发育与绒毛生产数量和质量息息相关。毛用哺乳动物的毛囊的生长发育一般经历三个阶段(休止期、生长期、退行期)周而复始的循环,它是一系列信号分子相互作用相互调控的结果,在这一过程中,外跟鞘(Outer root sheath,ORS)细胞的增殖被认为是毛囊生长发育的重要动力来源之一。近年来的研究发现,神经生长因子(nerve growth factor,NGF)除了在神经系统发挥作用以外,还在一些非神经系统发挥生物学功能,如有研究发现NGF可以影响小鼠毛囊的形态学变化,NGF及其受体存在于小鼠毛囊发育的不同阶段,说明NGF是小鼠毛囊发育过程中至关重要的一种因子。然而,作为重要的毛绒用动物—绒山羊的皮肤毛囊中是否存在NGF及其受体酪氨酸激酶A(tyrosine kinase A,TrkA),如果存在其功能又有哪些?绒山羊ORS细胞中是否是NGF的分泌细胞或作用靶细胞,NGF是否参与ORS细胞的增殖过程?针对上述假设本论文对此进行了系统的研究,并获得了相应的研究结果。1.NGF及其受体TrkA在绒山羊绒毛生长周期皮肤组织中的表达利用RT-PCR方法检测了皮肤组织中是否有NGF及其受体TrkAmRNA的表达,并利用实时荧光定量PCR和Western blot的方法对毛囊生长发育三个阶段皮肤组织中NGF及其受体TrkA的表达进行定量分析。结果表明:NGF及其受体TrkA的mRNA存在于毛囊生长周期各阶段的皮肤组织中;生长期皮肤组织中NGF及其受体TrkA mRNA的表达水平显著高于休止期和退行期(p<0.05);生长期皮肤组织中NGF蛋白水平显著高于休止期和退行期(p<0.05),生长期TrkA的蛋白水平与休止期没有显著差异,但显著的高于退行期(p<0.05)。利用HE染色观察毛囊生长发育三个阶段的绒山羊毛囊的形态。结果表明:在生长期,初级毛囊(Primary hair follicle,PF)和次级毛囊(Secondary hair follicle,SF)的数量要多于休止期和退行期,且毛囊结构完整、清晰;在退行期,PF和SF的数量显著降低。毛囊的结构松散,毛乳头(Dermal papilla,DP)、ORS和内根鞘(Internal root sheath,IRS)分层不清晰;在休止期,PF和SF的数量少,PF的ORS和IRS层清晰可见,但SF的ORS和IRS层不清晰。利用间接免疫荧光技术对NGF和TrkA的蛋白进行定位。结果表明:NGF和TrkA的蛋白存在于PF和SF毛囊生长周期的所有阶段;在生长期,在ORS和IRS细胞中检测到NGF的高表达,并且在ORS细胞中检测到TrkA的阳性信号。信号强度为生长期最高,休止期其次,退行期最低。2.NGF及其受体TrkA在体外培养绒山羊次级毛囊ORS细胞中的表达分离生长期绒山羊的SF,进行ORS细胞的体外分离与培养。结果表明:中性蛋白酶消化法分离毛囊省时省力,毛囊周围组织去除较干净,细胞不易污染;分离培养的ORS细胞于培养基中2~3天贴壁,细胞多呈多角形,少数为卵圆形,特异性蛋白CK19鉴定ORS细胞的特征,ORS细胞纯度在90%以上。利用间接免疫荧光技术发现ORS细胞中均可检测到NGF、TrkA的免疫活性,NGF在细胞核中的信号强度高于细胞质中,在细胞核中没有TrkA的免疫活性。利用ELISA方法发现体外培养的ORS细胞可以持续分泌NGF,但随着时间的延长,分泌量显著下降(p<0.05)。3.NGF对绒山羊次级毛囊ORS细胞增殖作用的研究通过外源性添加NGF重组蛋白及其受体阻断剂K252a的方法研究NGF对ORS细胞增殖的影响。结果表明:20ng/mL或100ng/mL的NGF重组蛋白可促进绒山羊次级毛囊ORS细胞的增殖,当用20ng/mL的K252a处理后,NGF的这种促增殖作用消失。说明NGF/TrkA系统可以以剂量依赖的方式促进ORS细胞的增殖。此外,我们利用细胞免疫荧光的方法研究了ORS细胞中是否存在环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)。结果表明:ORS细胞中检测到了CREB的免疫阳性信号,且细胞核中的信号强度强于细胞质中。外源性添加20ng/mL或100ng/mL NGF重组蛋白能显著的提高细胞中CREB的活性,且NGF提高细胞内CREB的活性依赖于NGF/TrkA。通过研究增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)mRNA的表达情况,发现NGF/TrkA系统在维持和促进PCNA表达过程中发挥着重要作用。综上所述,本论文证实了绒山羊毛囊组织中存在NGF及其高亲和力受体TrkA的mRNA和蛋白,且在毛囊生长期显著的高于其他时期。体外培养的外根鞘细胞能检测到NGF及其受体TrkA的蛋白,且在体外条件下,外根鞘细胞能持续分泌NGF。另外我们还发现NGF/TrkA路径影响转录因子CREB的活性,且这一路径影响增殖相关基因PCNA的表达。本研究结果初步探讨了NGF在毛囊中表达规律及其作用机制,为深入研究绒山羊绒毛生长机制提供了思路。