研究背景茜草科(Rubiaceae)钩藤属(Uncaria)植物全世界约有34种,分布于亚洲、澳大利亚、非洲大陆及马达加斯加、热带美洲。我国有11种、1变型,分布于广东、广西、云南、江西、湖南、福建、贵州、四川等省区。其中,广东产6种,即：钩藤Uncaria rhynchophylla (Miq) Miq. ex Havil..、大叶钩藤U. macrophylla Wall.、毛钩藤U. hirsute Havil.、无柄果钩藤(白钩藤)U. sessilifructus Roxb.、侯钩藤U. rhynchophylloides How和攀茎钩藤U.scandens (smith) Hutch.,主要分布于粤西北一带,资源丰富。传统中药钩藤味甘,性凉,归肝、心包经,具有清热平肝,息风定惊等功效。《中华人民共和国药典》2010年版记载正品钩藤包括：钩藤Uncaria rhynchophylla (Miq) Miq. ex Havil.、大叶钩藤U. macrophylla Wall.、毛钩藤U.hirsute Havil.、华钩藤U. sinensis (Oliv.) Havil和无柄果钩藤U. sessilifructus Roxb.。现代临床药理研究表明,中药钩藤对高血压、头痛、眩晕等有确切的疗效。该属植物含有吲哚类生物碱、三萜类化合物和黄酮类化合物等多种化学成分,其中吲哚类生物碱为主要的有效部位。目前,对广东省钩藤属植物资源尚缺乏一个全面和系统的研究,据调查广东省钩藤属药用植物资源丰富,具有较高的研究价值。近年来的研究表明,钩藤不仅其传统药用部位——带钩茎枝是一种药用资源,钩藤的叶、藤茎(不带钩茎枝,下同)也有作为药用资源的潜力,其来源更为丰富,药用价值及综合利用潜力都很大,但由于缺乏对广东省钩藤属植物的不同物种、不同药用部位的药学和药理毒理学系统、全面的研究,故一直没有被开发利用。研究目的对广东所产4种钩藤属植物进行不同物种、不同药用部位的总碱和3个有效成分钩藤碱、异钩藤碱及毛钩藤碱的含量测定；比较4种钩藤属植物不同药用部位的中枢抑制作用。建立一个适合广东所产4种钩藤属植物生物碱成分的高效液相色谱法和紫外分光光度法的检测条件,比较其不同物种、不同药用部位间有效成分的含量变化,为这一药用植物新资源的合理开发利用提供药学及药效学依据。实验方法1.钩藤生物碱提取方法的比较：选用冷浸法、热回流提取法、超声提取法3种方法,在此基础上分别比较多种提取溶剂(石油醚、80%乙醇、无水乙醇、甲醇、乙醚、氯仿)的提取效果。2.建立紫外分光光度法(UV)检测广东所产钩藤属植物钩藤、大叶钩藤、毛钩藤和侯钩藤的不同药用部位生物碱含量,分别以钩藤碱、毛钩藤碱为对照品计算总碱含量,检测波长分别为242nm、245nm。3.建立高效液相色谱法(HPLC)检测上述4种钩藤属植物的带钩茎枝、藤茎和叶3个药用部位的钩藤碱、异钩藤碱和毛钩藤碱含量：①采用HPLC等度洗脱法测定钩藤属植物中有效成分钩藤碱、异钩藤碱的含量,色谱条件：依利特Hypersil ODS C18柱(4.6mm×200mm,5μm)；甲醇-水(含0.50%三乙胺,冰乙酸调pH6.33)=63：37为流动相,流速0.80mL·min-1；进样量为5.00μL；柱温为室温；检测波长为245nm。②.采用HPLC梯度洗脱法测定毛钩藤碱含量,色谱条件：以依利特Hypersil ODS C18柱(4.6mm×200mm,5μm)为色谱柱,甲醇一水(含0.50%三乙胺,冰乙酸调pH5.35)为流动相,梯度洗脱,进样量为10.00μL；柱温为40℃；检测波长为245nm。4.4种钩藤属植物不同药用部位中枢抑制作用的比较研究①小鼠自发活动实验昆明种小鼠90只,雌雄各半,禁食12h,饮水不限。将小鼠随机分为9组,即空白对照组(同容量生理盐水组),大叶钩藤带钩茎枝组(15g·kg-1)、大叶钩藤叶组(15g·kg-1)、钩藤带钩茎枝组(15g·kg-1)、钩藤叶组(15g·kg-1)、侯钩藤带钩茎枝组(15g·kg-1)、侯钩藤叶组(15g·kg-1)、毛钩藤带钩茎枝组(15g·kg-1)和毛钩藤叶组(15g·kg-1),每组10只动物。将各组小鼠放入YLS-1A多功能小动物自主活动记录仪中,适应5min后,测定小鼠给药前的自主活动次数,记录时间为5min,记录时室内保持安静。然后按剂量给各组小鼠灌胃给药(ig)。分别于给药后30min,60min各测定1次自发活动数,记录5min内各组小鼠的自主活动数。②戊巴比妥钠阈下睡眠剂量诱导小鼠入睡实验取昆明种小鼠180只,雌雄各半,将小鼠随机分为9组,分组同上,每组20只动物。按上述各组剂量给小鼠灌胃(ig)给药,药后60min给每只小鼠腹腔注射戊巴比妥钠30mg·kg-1,以小鼠翻正反射消失1min以上为入睡标准,记录15min内各组小鼠的入睡个数。③戊巴比妥钠阈剂量诱导小鼠睡眠时间实验取昆明种小鼠90只,雌雄各半,禁食12h,饮水不限。将小鼠随机分为9组,分组同上,每组10只动物。按上述各组剂量给小鼠ig给药,药后60min给每只小鼠腹腔注射戊巴比妥钠50mg·kg-1,然后记录各组小鼠的睡眠时间(以小鼠翻正反射消失至恢复为睡眠时间)。④硝酸士的宁致小鼠惊厥作用实验取昆明种小鼠90只,雌雄各半,禁食12h,饮水不限。将小鼠随机分为9组,分组同上,每组10只动物。按上述各组剂量给小鼠ig给药,给药后60min,腹腔注射(ip)硝酸士的宁(1.5mg·kg-1),记录2h内惊厥小鼠个数和死亡小鼠个数。5.统计方法：①主要化学成分含量测定方面的数据整理,应用excel97-2003软件进行计算。②中枢抑制作用实验数据以(x±s)表示。应用SPSS13.0统计软件进行完全随机设计资料的单因素方差分析,重复测量方差分析,组间多重比较方差齐时用LSD方法,不齐时用Games-Howell方法。P<0.05表示差异有统计学意义。计数资料采用χ2检验。结果1.通过比较了热回流提取法、超声提取法、冷浸法3种不同提取方法以及多种提取溶剂(石油醚、80%乙醇、无水乙醇、甲醇、乙醚、氯仿)的提取效果,综合时效性、安全性以及大生产可能性考虑,本实验最终确立样品溶液的提取方法为采用浓氨水润湿,20倍量的无水乙醇超声提取2次,每次40mmin,合并滤液,酸水除杂,再用乙醚萃取有效部位。2.以钩藤碱为对照品或以毛钩藤碱为对照品计算上述4种钩藤属植物的总碱含量,结果均表明总碱含量在不同物种、不同药用部位里存在差异性,其中以钩藤碱计算总碱含量的UV测定中,其线性范围为6.00～14.00μg·mL-1,r=0.9985,以大叶钩藤带钩茎枝所含的总碱含量最高,为0.478%；以毛钩藤碱计算总碱含量的UV检测中,其线性范围为2.00～10.00μg·mL-1,r=0.998,测得大叶钩藤叶所含总碱含量最高,为0.778%。3. HPLC检测,钩藤碱、异钩藤碱在0.02～5.00μg范围内线性关系良好,钩藤碱的r1=0.9995,异钩藤碱的r2=0.9995,平均回收率分别为98.52%、99.12%(RSD1=2.05%,RSD2=2.17%)；毛钩藤碱在0.02～0.40μg范围内线性关系良好,r=0.9995,平均回收率分别为96.83%,RSD=1.60%。4.中枢神经系统抑制试验结果①药物对小鼠自主活动的影响小鼠的活动次数在给药前后不同时间之间差异有显著性意义(F=114.228,P<0.001),9组均在给药前为最大值,除空白组外其余8组给药后活动次数随时间呈显著下降趋势,至60mmin达最小值,其中以大叶钩藤带钩茎枝组的下降趋势最为明显。9组之间无显著差异(F=1.407,P=0.206),给药前、给药后30min9组均无显著差异(P药前=0.653,P药后30min=0.150),而给药后60min9组均有显著差异(P=0.001)。在给药后60min,空白组的自主活动数略呈上升趋势,均高于其余8组。时间点和组别之间有交互效应(F=2.011,P=0.018),通过对9组每个时间点的两两比较,所有带钩茎枝组及叶组于30分钟即与给药前有显著差异。通过对3时间点对每组的两两比较,给药前,空白组与其余8组之间无显著差异；给药后30min,空白组除与大叶钩藤带钩茎枝组之间有显著差异外,与其他7组之间无显著差异；给药后60min,空白组除了与侯钩藤带钩茎枝组、侯钩藤叶组之间无显著差异,与其余6组间均有显著差异。②戊巴比妥钠阈下睡眠剂量诱导小鼠入睡实验小鼠翻正反射消失(入睡)为阳性,各组小鼠入睡个数经χ2检验表明,χ2=27.596,v=8,P=0.001,差异有显著性意义。由表可知,空白组在腹腔注射阈下睡眠剂量的戊巴比妥钠(30mg·kg-1)后,翻正反射消失小鼠为3只；各给药组小鼠入睡个数均较空白组多,其中钩藤带钩茎枝组小鼠入睡个数最多,有15只,其次是大叶钩藤带钩茎枝组和大叶钩藤叶组,分别有14只和12只小鼠入睡,其他组的入睡个数渐少。③戊巴比妥钠阈剂量诱导小鼠睡眠时间实验各组小鼠睡眠时间数据经One-Way ANOVA分析表明组间有显著性差异(F=4.765,P<0.001),需进一步两两比较(方差不齐,采用Games-Howen法)。结果表明,空白组与大叶钩藤带钩茎枝组比较,有显著差异(P=0.001)；与大叶钩藤叶组比较,有显著差异(P=0.016)；与钩藤带钩茎枝组比较,有显著差异(P<0.001)。说明大叶钩藤带钩茎枝组、大叶钩藤叶组和钩藤带钩茎枝组小鼠睡眠时间明显延长。其余各给药组与空白组比较,无显著性差异(P>0.05)。④药物对硝酸士的宁致小鼠惊厥作用的影响给小鼠腹腔注射硝酸士的宁(1.5mg·kg--1)后,小鼠在5mmin内出现强直性惊厥和死亡。小鼠惊厥为阳性,各组小鼠惊厥个数经χ2检验,χ2=10.827,v=8,P=0.212,差异无显著性意义,可认为9个实验组之间的小鼠惊厥个数无显著性差异。小鼠死亡为阳性,各组小鼠死亡个数经χ2检验,χ2=27.569,v=8,P=0.001,有显著性差异,各给药组小鼠死亡个数均较空白组少,其中大叶钩藤叶组的小鼠死亡个数最少。结论1.目前从钩藤中已分离出30多种化合物,主要为吲哚类生物碱,其中钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛因碱、异柯诺辛因碱含量较高,其中互为同分异构体的钩藤碱和异钩藤碱,往往以1：1关系存在于钩藤属植物中,因此,以总碱和钩藤碱、异钩藤碱的含量评价钩藤药材是合理的。从化学性质上看,钩藤碱和异钩藤碱均溶于乙醇、氯仿等,考虑到氯仿的毒性大和价格较贵,选择乙醇作为提取溶剂是可行的；而3种提取方法,通过实验检测发现超声提取法效率高,所需时间和溶剂都比热提取和冷浸法少,故最终确定超声提取法为本实验的提取方法。2.UV检测钩藤总碱含量,以钩藤碱计算总碱含量,其大小依次是大叶钩藤带钩茎枝>大叶钩藤叶>毛钩藤带钩茎枝>钩藤带钩茎枝>侯钩藤带钩茎枝>钩藤藤茎>钩藤叶>大叶钩藤藤茎>毛钩藤藤茎>毛钩藤叶>侯钩藤藤茎>侯钩藤叶。以毛钩滕碱计算总碱含量,其高低排序是大叶钩藤叶>钩藤叶>大叶钩藤钩茎(带钩茎枝和藤茎,下同)>钩藤钩茎>毛钩藤钩茎>毛钩藤叶>侯钩藤叶>侯钩藤钩茎。3.HPLC测定钩藤碱、异钩藤碱和毛钩藤碱的含量,其中所测得钩藤碱和异钩藤碱含量最高的是大叶钩藤的叶部位,分别为0.1632mg·g-1和0.0694mg·g-1；毛钩藤碱含量最高的是大叶钩藤钩茎部位,含202.5μg·g-1；所确立的HPLC方法准确,操作简便、快速,重复性较好,精密度较高,可用于对广东省钩藤属植物不同物种、不同药用部位的有效成分钩藤碱、异钩藤碱和毛钩藤碱含量的测定。4.4种钩藤属植物的醇提物能够显著降低小鼠的自主活动,增加翻正反射消失的小鼠个数,延长小鼠睡眠时间,减少硝酸士的宁致惊厥小鼠的死亡个数和小鼠惊厥个数,其中,以大叶钩藤的作用最为明显。