目的:糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病的一种慢性并发症,严重危害人类的健康甚至生命。尽管肾小球损伤在糖尿病肾病早期就已出现,但研究证实肾小管损伤在糖尿病肾功能受损过程中发挥着更重要作用。肾小管上皮细胞转分化,上皮细胞转化成肌成纤维细胞导致细胞外基质分泌及肾小管间质纤维化是严重影响糖尿病患者肾脏功能的病理学改变。DKD的病因及发病机制复杂,涉及到多种因素,高糖作为影响糖尿病病人正常细胞代谢和功能的根本性因素,能够导致肾近端小管上皮细胞的功能和结构改变及细胞外基质沉积,引发肾小管间质纤维化,在糖尿病肾损伤中发挥着重要作用。目前已知多条信号传导途径和糖尿病肾小管细胞外基质沉积有关,包括P38MAPK、ERK1/2和JAK/STAT等。近年来,PI3K/Akt通路被揭示与肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质沉积增多相关。活化的PI3K可催化膜表面PI(4,5)P2肌醇环上的3’羟基位磷酸化形成PI(3,4,5)P3。PI(3,4,5)P3作为第二信使与Akt及磷脂酰肌醇依赖的蛋白激酶PDK1的PH区结合,不仅导致Akt发生从细胞质到细胞膜的转位,还促使其构象发生变化被活化引起上皮细胞转分化及细胞外基质沉积。含SH2结构域的5’肌醇磷酸酶(SH2 domain-containing inositol5’-phosphatase,SHIP)可从PI(3,4,5)P3的5’位去除磷酸而将其转变为PI(3,4)P2,发挥对PI3K/Akt通路的负向调控作用。慢性髓性白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)细胞系K562细胞中SHIP基因缺失或位点突变后,通过影响5’磷酸酶活性导致PI3K/Akt途径激活,降低依托泊苷化疗药物敏感性,使细胞增殖能力提高。新近有研究显示,SHIP通过负向调控PI3K/Akt通路,在细胞外基质分泌及纤维化的发生过程中发挥作用。mi R-155敲除的小鼠中SHIP蛋白表达增加,抑制PI3K/Akt信号转导通路,减轻博莱霉素在皮肤诱导的胶原合成及纤维化。SHIP基因敲除小鼠中,活化的Akt促进气管上皮下胶原沉积,同时伴随TGF-β1显著增加。但糖尿病肾病中,SHIP是否通过调控PI3K/Akt通路参与了糖尿病肾小管上皮细胞外基质沉积及纤维化的发生、发展及明确的机制还未见报道。本课题通过建立糖尿病小鼠模型和体外培养肾小管上皮细胞HK2,系统探讨了SHIP表达对肾小管上皮细胞外基质沉积以及间质纤维化的作用和调节机制,为糖尿病肾小管间质纤维化的延缓和防治提供新的研究思路,探索新的干预靶点。方法:1 SHIP蛋白在糖尿病小鼠肾组织中的表达雄性CD1小鼠随机分为正常对照组(Control组)和糖尿病组(diabetic mellitus,DM组)。糖尿病模型小鼠腹腔单次注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ,溶于0.1 M无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中,p H 4.4,150 mg/kg),对照组小鼠只注射相当体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,72 h后尾尖取血测定血糖,血糖≥16.7 m M者确定为糖尿病模型成功。DM小鼠成模后,每周监测血糖,不符合标准者弃去,且于成模16周后留取24 h尿液和血清,处死DM组小鼠及对照组小鼠,切取肾脏。切取部分肾组织固定于4%多聚甲醛,用于HE染色、Masson染色及免疫组织化学检测;部分肾皮质组织用于提取蛋白及RNA。免疫组织化学和Western blot检测肾皮质SHIP、phospho-Akt(Ser 473)、phospho-Akt(Thr 308)、Akt、TGF-β1、E-cadherin、α-SMA、Col 1和Col 3蛋白的表达,Real-time PCR检测TGF-β1m RNA表达。2 SHIP表达对体外培养肾小管上皮细胞外基质分泌的影响人肾小管上皮细胞HK2在37°C,5%CO2培养箱内用含10%的胎牛血清及1%青链霉素混合液的DMEM-F12培养基培养。⑴检测高糖对HK2细胞SHIP表达及细胞外基质分泌的影响:将实验细胞随机分为5组,实验前用无血清培养基培养细胞,使细胞同步化。高糖刺激细胞0、12、24、36、48 h后收集细胞,免疫荧光检测SHIP表达,Western blot检测SHIP、phospho-Akt(Ser 473)、phospho-Akt(Thr 308)、Akt、TGF-β1、E-cadherin及α-SMA蛋白表达,ELISA方法检测细胞外分泌Col 3蛋白。⑵检测敲低SHIP基因对正常糖培养的HK2细胞外基质分泌的直接影响:使用Lipofectamine?RNAi MAX转染试剂将SHIP si RNA和阴性对照negative control si RNA分别转染人肾小管上皮HK2细胞。细胞随机分为正常对照组(normal control)、阴性对照组(negative control)、SHIP si RNA转染组(SHIP si RNA)。转染48 h后Western blot检测SHIP、phospho-Akt(Ser 473)、phospho-Akt(Thr 308)、TGF-β1、E-cadherin及α-SMA蛋白表达,ELISA方法检测细胞外分泌Col 3蛋白。⑶检测过表达SHIP基因对高糖诱导的HK2细胞外基质分泌的影响:使用Fu GENE?6转染试剂将重组质粒M90-SHIP和空白质粒M90分别转染入人肾小管上皮HK2细胞。细胞随机分为正常糖组(5.5 m M glucose,normal glucose,NG)、高糖组(30 m M glucose,high glucose,HG)、高糖+空白质粒转染组(high glucose+control vector,HG+M90)、高糖+SHIP质粒转染组(high glucose+SHIP vector,HG+M90-SHIP)。转染成功后高糖刺激48 h进行相关指标的检测,检测方法及指标同上。⑷检测抑制PI3K/Akt通路对高糖诱导的HK2细胞外基质分泌的影响:细胞随机分为正常糖组(5.5 m M glucose,normal glucose,NG)、高糖组(30 m M glucose,high glucose,HG)、高糖+DMSO组(high glucose+DMSO,HG+DMSO)、高糖+30μM LY294002组(high glucose+LY294002,HG+LY294002)。⑸检测抑制TGF-β1信号通路对敲低SHIP基因导致的HK2细胞外基质分泌的影响:细胞随机分为正常糖组(normal glucose,NG)、正常糖+SHIP si RNA转染组(NG+SHIP si RNA)、正常糖+SHIP si RNA转染+3μM SB431542组(NG+SHIP si RNA+SB431542)。检测方法及指标同上。3腹腔注射重组腺病毒r Ad-INPP5D对糖尿病小鼠肾小管上皮细胞外基质沉积的影响STZ腹腔注射诱导糖尿病小鼠成模8周后,根据随机分配原则将24只糖尿病小鼠分为:糖尿病组(DM group)、腺病毒对照组(DM+r Ad-EGFP group)和SHIP重组腺病毒组(DM+r Ad-INPP5D group);同周龄健康雄性CD1小鼠8只作为对照组(Control group)。腺病毒组小鼠于糖尿病成模8周后经腹腔注射腺病毒载体5×108 PFU/只,每10天补注射一次,剂量同前,腺病毒注射8周后留取24 h尿液和血清,处死小鼠后切取肾脏。切取部分肾组织固定于4%多聚甲醛,用于HE染色、Masson染色及免疫组织化学检测;部分肾皮质组织用于提取蛋白及RNA。免疫组织化学和Western blot检测肾皮质SHIP、phospho-Akt(Ser 473)、phospho-Akt(Thr 308)、Akt、TGF-β1、E-cadherin、α-SMA、Col 1及Col 3蛋白表达,Real-time PCR检测TGF-β1 m RNA表达。结果:1 SHIP蛋白在糖尿病小鼠肾组织中的表达⑴与正常对照组小鼠相比,糖尿病组小鼠食量、尿量、血糖、肌酐、尿素氮、甘油三酯及肾重/体重均显著升高(P<0.05)。⑵HE、Masson染色可见糖尿病组小鼠肾小球体积增大,系膜基质增多,间质增宽细胞外基质沉积增多。⑶免疫组化显示SHIP、phospho-Akt(Ser 473,Thr 308)主要在肾小管上皮细胞表达。正常对照组SHIP在肾小管上皮细胞胞浆中大量表达,而糖尿病小鼠组SHIP在肾小管上皮细胞胞浆中仅见少量表达,与对照组相比降低86.7%;phospho-Akt(Ser 473,Thr 308)在对照组肾小管有少量表达,在糖尿病组表达明显增加,与对照组相比分别增加2.99倍和2.64倍。Western blot检测显示,与对照组比较,糖尿病组小鼠肾组织中SHIP蛋白表达下降73.19%,phospho-Akt(Ser 473,Thr 308)蛋白表达分别升高3.40倍和3.22倍。⑷免疫组织化学检测结果显示糖尿病组小鼠肾组织中TGF-β1在肾小管上皮细胞胞浆中大量表达,E-cadherin在肾小管细胞浆及细胞膜表达明显减少,α-SMA除在血管平滑肌细胞表达之外,且在肾小管上皮细胞胞浆及间质中大量表达,Col 1和Col 3大量表达于肾小管上皮细胞胞浆及肾间质中,与对照组比较均有显著性差异(P<0.05)。Western blot检测结果同样显示,糖尿病组小鼠肾皮质组织TGF-β1、α-SMA及Col 3蛋白表达与正常对照组相比分别增高1.99倍、2.48倍和4.51倍,E-cadherin表达降低67.38%。Real-time PCR结果显示,糖尿病组小鼠肾皮质组织TGF-β1m RNA表达明显高于对照组小鼠(P<0.05)。2 SHIP表达对体外培养肾小管上皮细胞外基质分泌的影响⑴与高糖0 h相比,SHIP蛋白在高糖刺激24 h开始降低,且随高糖刺激时间延长呈降低趋势,高糖刺激48 h SHIP表达量较高糖刺激0 h表达量较低62.2%。高糖刺激下Akt磷酸化水平升高,phospho-Akt(Ser 473)和phospho-Akt(Thr 308)的表达呈时间依赖性,48 h后表达量分别是高糖刺激0 h表达量的2.19倍和3.50倍。高糖刺激下细胞出现转分化且细胞外基质分泌增多,TGF-β1、α-SMA及分泌的Col 3表达量于48 h时分别是高糖刺激0 h表达量的2.08倍、4.96倍及1.41倍,E-cadherin表达量减少61.6%。⑵SHIP si RNA转染正常培养的HK2细胞明显降低SHIP蛋白的表达(P<0.05)。SHIP si RNA转染正常培养的HK2细胞Akt磷酸化水平明显升高,phospho-Akt(Ser 473)和phospho-Akt(Thr 308)的表达量分别是阴性对照组表达量的4.76倍和3.89倍,细胞出现转分化且细胞外基质分泌增多,TGF-β1、α-SMA及分泌的Col 3表达增高,E-cadherin表达减少(P<0.05)。⑶M90-SHIP质粒转染过表达SHIP蛋白能够显著抑制高糖诱导的Akt活化,phospho-Akt(Ser 473)和phospho-Akt(Thr 308)的表达量较M90空质粒转染组表达量分别降低42.2%和38.3%。过表达SHIP基因减少高糖诱导的细胞外基质分泌,M90-SHIP质粒转染组与M90空质粒转染组相比TGF-β1、α-SMA及Col 3表达量分别降低48.9%、59.4%和43.7%,E-cadherin表达量增加2.11倍。⑷LY294002能显著抑制高糖诱导的Akt磷酸化,phospho-Akt(Ser 473)和phospho-Akt(Thr 308)表达量分别降低73.4%和54.3%。阻断PI3K/Akt信号通路可减轻高糖导致的细胞转分化,LY294002组TGF-β1和α-SMA蛋白分别降低65.9%和65.7%,而E-cadherin蛋白增加1.87倍。LY294002同时可逆转高糖导致的SHIP蛋白低表达(P<0.05)。⑸与SHIP si RNA转染组相比,TGF-β1信号通路阻断剂SB431542显著降低HK2细胞α-SMA及分泌的Col 3表达量,表达量分别降低37.4%和51.2%,而E-cadherin蛋白增加1.99倍。3腹腔注射SHIP重组腺病毒(r Ad-INPP5D)对糖尿病小鼠肾小管上皮细胞外基质沉积的影响⑴糖尿病组与腺病毒对照(r Ad-EGFP)组的小鼠食量、尿量、血糖、肌酐、尿素氮、甘油三酯及肾重/体重均显著高于对照组,腹腔注射SHIP重组腺病毒(r Ad-INPP5D)可显著改善糖尿病小鼠的肌酐、尿素氮、甘油三酯(P<0.05),但小鼠食量、尿量、血糖及肾重/体重均无显著差异(P>0.05)。⑵Masson染色观察,糖尿病组和r Ad-EGFP组的小鼠与对照组相比间质增宽细胞外基质沉积增多,单核及淋巴细胞浸润明显,r Ad-INPP5D组糖尿病小鼠的上述病理改变明显减轻。⑶免疫组织化学检测结果显示:糖尿病组和r Ad-EGFP组与对照组相比SHIP蛋白表达减少,仅见肾小管上皮细胞胞浆中少量表达,而r Ad-INPP5D组SHIP蛋白表达明显增多,表达量是r Ad-EGFP组的2.91倍;糖尿病组和r Ad-EGFP组phospho-Akt(Ser473,Thr 308)在肾小管上皮细胞胞浆中表达显著增多,而r Ad-INPP5D组逆转了糖尿病导致的phospho-Akt(Ser 473,Thr 308)蛋白表达增加(P<0.05)。Western Blot检测结果显示:糖尿病组和r Ad-EGFP组与对照组相比SHIP蛋白表达减少,而r Ad-INPP5D组小鼠肾皮质组织中SHIP蛋白表达与r Ad-EGFP组相比增加3.36倍;糖尿病导致的phospho-Akt(Ser473,Thr 308)表达升高,在r Ad-INPP5D组小鼠肾皮质组织中分别被下调65.26%和70.38%;总Akt在各组小鼠肾皮质组织中的表达没有明显差异(P>0.05)。⑷免疫组织化学检测结果显示,糖尿病组和r Ad-EGFP组TGF-β1在肾小管上皮细胞胞浆中大量表达,E-cadherin在肾小管细胞浆及细胞膜表达明显减少,Col 1和Col 3大量表达于肾小管上皮细胞胞浆及肾间质中,而r Ad-INPP5D组过表达SHIP降低糖尿病导致的肾小管上皮细胞胞浆中TGF-β1表达,减少肾小管上皮细胞胞浆及肾间质中Col 1和Col 3表达,并逆转糖尿病诱导的E-cadherin蛋白低表达(P<0.05)。Western blot检测结果显示,与对照组相比,糖尿病组和r Ad-EGFP组TGF-β1、α-SMA及Col 1蛋白显著增加,E-cadherin蛋白表达降低,腹腔注射腺病毒r Ad-INPP5D可导致糖尿病诱导的TGF-β1、α-SMA及Col 1表达分别降低47.66%、44.52%和59.13%,E-cadherin蛋白增加2.48倍。Real-time PCR结果显示,r Ad-INPP5D组可逆转糖尿病导致的TGF-β1m RNA表达增加(P<0.05)。结论:1在糖尿病小鼠肾组织及高糖培养的HK2细胞中SHIP表达降低,且伴随PI3K/Akt信号通路激活,细胞外基质沉积增多。提示SHIP/PI3K/Akt信号通路可能参与糖尿病肾病肾小管上皮细胞外基质沉积导致的细胞损伤。2应用小干扰RNA技术抑制正常糖培养下HK2细胞SHIP的表达,能促进PI3K/Akt信号通路激活,且显著增加肾小管上皮细胞外基质分泌,提示SHIP对肾小管上皮细胞有保护作用,高糖刺激导致的肾小管上皮细胞外基质分泌可能是通过降低SHIP表达实现的。3 SHIP基因过表达及LY294002通过抑制PI3K/Akt信号通路活化,减轻了糖尿病小鼠肾组织及高糖培养的HK2细胞细胞外基质分泌,提示SHIP可通过抑制PI3K/Akt信号通路来产生对糖尿病肾病的治疗效果。4 SB431542阻断敲低SHIP导致的HK2细胞外基质分泌,提示HK2细胞SHIP表达下降所导致的细胞外基质分泌是通过TGF-β1通路实现的。