SSc是一种以广泛的皮肤或者内脏器官纤维化为特点的自身免疫性结缔组织疾病。其主要病理特征为细胞外基质蛋白的过度沉积。目前SSc发病机理尚不明确,但其过度纤维化发生与组织修复失控密切相关。研究发现,多种促纤维化因子在SSc纤维化过程中发挥重要作用,其中研究最多、最重要的为TGF-β。TGF-β具有多种功能活性,包括调控细胞分化、细胞增殖及诱导细胞外基质蛋白的合成。近年来,TGIF因其具有抑制TGF-β活性而受到学者的广泛关注。TGIF通过限制细胞核内cPML基因激活来抑制Smad2磷酸化,从而抑制TGF-β信号传导通路。姜黄素是从姜科姜黄属植物的根茎提取的一种酚类色素,其主要药理作用包括抗炎、抗氧化、抗纤维化、抗肿瘤等活性。文献报道,姜黄素具有抑制TGF-β-Smad信号传导活性,抗TGF-β诱导的纤维化作用。但姜黄素抗SSc纤维化的研究国内外尚无报道。本研究假设姜黄素通过调控下游细胞因子TGIF,从而发挥抑制SSc成纤维细胞TGF-β诱导纤维化作用。为验证这一假设,我们选择SSc成纤维细胞进行体外培养,对姜黄素抑制TGF-β诱导的纤维化作用机制进行研究。第一部分姜黄素抑制SSc成纤维细胞TGF-β信号信号系统目的:研究姜黄素对SSc成纤维细胞TGF-β诱导的纤维化细胞因子的影响,验证姜黄素的抗SSc纤维化活性。方法:传代的SSc成纤维细胞,实验分为5组:空白对照组、单纯TGF-β刺激组、低浓度药物处理组、中浓度药物处理组、高浓度药物处理组(药物为姜黄素)。按实验设计方法处理后,进行Western blot分析和细胞荧光素酶活性测定。结果:1.Western blot分析表明:TGF-β上调SSc成纤维细胞中促纤维化因子I型胶原、纤连蛋白及PAI-1蛋白的表达,姜黄素可以明显降低TGF-β诱导的I型胶原、纤连蛋白及PAI-1蛋白水平。2.细胞荧光素酶活性表明:TGF-β可以显著诱导增加SSc成纤维细胞荧光素酶活性;姜黄素能明显降低SSc成纤维细胞的细胞荧光素酶活性,且呈剂量依赖。结论:姜黄素抑制TGF-β诱导的I型胶原、纤连蛋白及PAI-1蛋白表达水平,降低SSc成纤维细胞荧光素酶活性,具有显著的抗SSc纤维化活性。第二部分姜黄素抑制Smad2磷酸化并上调TGIF表达目的:研究姜黄素对SSc成纤维细胞中TGIF及Smad2磷酸化表达水平的影响,探讨姜黄素抗SSc纤维化的作用机制。方法:传代的SSc成纤维细胞,实验分4组:空白对照组、低浓度药物处理组、中浓度药物处理组、高浓度药物处理组(药物为姜黄素)。按实验设计方法处理后,进行Western blot分析。结果:Western blot分析表明1.姜黄素明显抑制TGF-β诱导Smad2磷酸化水平TGF-β能够显著诱导Smad2、Smad3磷酸化表达,姜黄素可以明显降低TGF-β诱导Smad2磷酸化表达水平;但姜黄素对TGF-β诱导Smad3磷酸化无影响。2.姜黄素可以增加TGIF蛋白的表达水平姜黄素可以显著增加TGIF蛋白的表达水平,且呈剂量依赖;TGF-β对姜黄素上调TGIF无影响。结论:姜黄素通过上调TGIF蛋白表达、降低Smad2磷酸化水平发挥抑制SSc纤维化作用。第三部分姜黄素抑制Smad2磷酸化需要TGIF存在目的:研究TGIF存在与否是否对SSc成纤维细胞Smad2磷酸化表达水平有影响,进一步探讨姜黄素抑制SSc纤维化的作用机制。方法:传代的SSc成纤维细胞,实验分2组: TGIF siRNA转染组和非特异siRNA转染组。采用基因沉默技术对各组进行细胞转染,转染使用脂质体2000。接下来按实验设计进行Western blot分析及细胞荧光素酶活性检测。结果:1.Western blot分析表明:①TGIF siRNA转染组成纤维细胞TGIF表达水平降低;②TGIF siRNA转染组TGF-β诱导磷酸化Smad2、纤连蛋白和PAI-1表达水平升高;③姜黄素明显降低非特异siRNA转染组TGF-β诱导磷酸化Smad2、纤连蛋白及PAI-1表达水平,对TGIF siRNA转染组无抑制作用。2.细胞荧光素酶活性表明:①两组细胞Smad2转录活性无明显差异;②TGF-β能够明显增强两组细胞荧光素酶活性,但是TGIF siRNA转染组升高明显,两组存在显著性差异;③姜黄素明显降低非特异siRNA转染组细胞荧光素酶活性,两组降低程度存在显著差异。结论:姜黄素抑制SSc成纤维细胞磷酸化Smad2表达需要TGIF存在。第四部分姜黄素上调TGIF表达通过减少蛋白酶体介导的TGIF降解目的:研究姜黄素对SSc成纤维细胞中TGIF基因、蛋白合成、蛋白降解及泛素化表达水平影响,进一步探讨姜黄素上调TGIF表达的作用机制。方法:传代的SSc成纤维细胞。1.RT-qPCR法:实验分4组:空白对照组、低浓度药物处理组、中浓度药物处理组、高浓度药物处理组。2.Western blot分析:实验分4组:姜黄素组、MG132组、姜黄素+MG132组及空白对照组。3.Western blot分析:实验分3组:姜黄素+CHX组、CHX组及空白对照组。4.免疫沉淀物分析:实验对象为MG132孵育的SSc成纤维细胞。实验分2组:姜黄素组及对照组。结果:1.RT-qPCR方法表明:姜黄素对SSc成纤维细胞TGIF mRNA表达水平无影响。2.Western blot分析表明:姜黄素与MG132均能够增加成纤维细胞TGIF蛋白的表达,姜黄素不能累积增加细胞TGIF蛋白的表达水平。3.Western blot分析表明:姜黄素可以减少SSc纤维细胞TGIF蛋白降解。CHX阻断细胞蛋白合成,促进蛋白降解,姜黄素能够抑制成纤维细胞中TGIF蛋白降解。4.免疫沉淀物检测表明:姜黄素可以明显降低SSc纤维细胞TGIF泛素化水平。结论:姜黄素通过抑制TGIF泛素化水平来减少TGIF蛋白的降解,从而上调TGIF表达水平。总之,姜黄素能降低TGF-β诱导的I型胶原、纤连蛋白及PAI-1的表达,具有显著的抗SSc纤维化活性。姜黄素抑制SSc TGF-β信号传导的新机制:姜黄素通过降低成纤维细胞TGIF泛素化水平,抑制TGIF蛋白降解来上调TGIF表达,从而发挥抗SSc纤维化活性。本研究为将来临床应用姜黄素治疗SSc提供了理论依据及指导。