目的：针对我省道地药材化橘红-毛橘红富含黄酮类成分的特点,提取其有效部位,系统研制化橘红抗氧化保健食品,为该珍稀药材资源的开发利用奠定坚实的研究基础和科学依据。方法：采用PSC法进行不同配比的组方抗氧化性评价,采用Caco-2细胞模型考察柚皮素及配伍组方的转运机制,确定合理的处方配比组成及比例,进行组方优化设计。采用UPLC法同时测定化橘红中柚皮苷、野漆树苷、柚皮素和芹菜素等活性成分含量；采用保健食品法、铝盐络合法、SBC法三种方法进行总黄酮测定对比研究,确定总黄酮含量测定最优方法；采用HPLC法建立不同栽培品种化橘红色谱指纹图谱库；完善原料药的质量标准。采用Central Composite Design响应面试验进行总黄酮提取工艺研究,选取乙醇浓度、乙醇用量、pH值三个因素,以总黄酮得率和黄酮清除率为考察指标,确定化橘红总黄酮最佳提取工艺；采用Box-Behnken的中心试验设计进行响应面试验,选取酶用量、pH值、温度及时间四个因素,以脱苦率为考察指标,优化柚苷酶酶解工艺；采用旋转压片制粒机压片,采用Box-Behnken的中心试验设计原理,选取酸和碱的比例、甘露醇用量、PEG6000用量及PVP-K30浓度四个因素,以硬度、崩解时间为考察指标,优化泡腾片制备工艺,确定最佳工艺参数,制订工艺路线图。采用UPLC法快速测定化橘红维C泡腾片中柚皮素、芹菜素含量,采用薄层色谱法对化橘红维C泡腾片中柚皮素、芹菜素进行鉴别,采用国家颁布的保健食品检验指南中规定的总黄酮测定法测定化橘红维C泡腾片中总黄酮含量,照2010版《中国药典》中崩解度、重量差异等测定方法和要求,测定并建立化橘红维C泡腾片质量标准。根据2003年版《保健食品检验与评价技术规范》要求,开展抗氧化功能评价研究。采用溴代苯肝脂质过氧化小鼠动物模型,采用试剂盒法测定血和肝脏中过氧化脂质降解产物MDA、LPO含量、SOD、GSH-Px等抗氧化功能酶指标,初步评价本研究产品的抗氧化活性。结果1配方设计以柚皮苷、野漆树苷、柚皮素为代表的化橘红总黄酮作为功效成分实现抗氧化的功能；以维生素C、化橘红中特有的肌醇作为营养源补充维生素;采用独特先进的生物酶技术对化橘红提取物进行脱苦,以阿斯巴甜、甘露醇作为复合甜味剂,通过调节柠檬酸与碳酸氢钠的比率来控制pH值。以化橘红挥发油β-环糊精包合物作为赋香剂,以化橘红总黄酮粉末固有的棕黄色作为着色；柠檬酸-酒石酸,碳酸氢钠聚乙二醇包合物作为泡腾剂,以羧甲基淀粉钠作为泡腾片的崩解剂。按照科学理论有机结合,通过柚皮素的增效协同作用,以少量维生素C与柚皮素配比达到更好的抗氧化作用。采用先进的PSC法优化组方配比,结果最佳配比为脱苦总黄酮+维生素C=2：1时,PSC值相当于65.219μmol水溶性维生素E (Trolox)所表现出的抗氧性能力。采用Caco-2细胞模型证明与维生素C配伍,可以增加柚皮素的吸收,并减少其外排作用。2原料药质量标准研究2.1取样部位对有效成分的含量有一定的影响,其中对柚皮苷的影响较为有规律性,顶端采集部位的柚皮苷含量相对较高。不同化橘红(毛橘红)品种黄酮类含量有异,其中假西洋的柚皮苷含量较高,黄绒果的野漆树苷、柚皮素、芹菜素含量较高。2.2不同总黄酮测定方法对比结果显示,“铝盐络合法”测得值显著大于保健食品法和SBC法测得值。SBC方法是较为先进的国际公认的总黄酮测定方法,但由于反应过程步骤较多,该方法的稳定性还有待考察。保健食品法不需经显色直接测定,其结果准确、简便,测定方法较为合理,综合考虑,选用保健食品法测定化橘红中总黄酮含量。2.3建立了50批化橘红药材的指纹图谱库,采用相似度评价系统A版进行数据处理,不同栽培品种化橘红药材指纹图谱的相似度均高于0.93。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004B版”软件将各栽培品种对照图谱与50批化橘红指纹图谱进行相似度计算,以相似度最高者作为栽培品种判定结果。结果显示,除12、32、33、34号误判外,其余46批化橘红均可通过相似度判别出栽培品种,判定成功率达92%。3泡腾片制备工艺研究3.1化橘红总黄酮提取工艺：采用响应面试验法对化橘红总黄酮提取工艺进行了进一步优化,其最佳工艺为：取化橘红粗颗粒,第一次加25倍水,浸泡0.5小时后,煮沸2小时,滤过,药渣第二次加20倍水,煮沸1.5小时,滤过,合并滤液。浓缩至1g/mL,缓缓加入95%乙醇,边加边搅拌,使其含醇量达到78.5%,继续加入适量一定浓度乙醇使其达到生药量的8倍量,用40%NaOH调节pH值至7.0,搅拌15分钟后,滤过,滤渣用适量一定浓度乙醇分次洗涤,并入滤液,回收乙醇,浓缩至1g/mL,加入适量蒸馏水使其浓度为0.6g/mL,5mol/L盐酸调pH至1.3,冷藏,一定时间后取出,滤过,沉淀用适量蒸馏水洗涤,60℃干燥,粉碎,过筛,得化橘红总黄酮粉末。3.2化橘红总黄酮脱苦工艺：根据响应面优化试验结果,化橘红总黄酮最佳脱苦条件为当柚苷酶用量1.6U/mL、酶解温度54℃、酶解时间132分钟时,脱苦率达到98.88%。3.3泡腾片制备工艺：优选出的结果为：取化橘红提取物,加入甘露醇制成药材软材,过24目筛；柠檬酸14份、酒石酸7份、羧甲基淀粉钠2.6份、维生素C3.4份、阿斯巴甜0.3份与甘露醇6份制成酸系统软材,过24目筛；碳酸氢钠17.5份、聚乙二醇-60002份制成碱系统软材,过24目筛；将三种软材分别制粒、烘干、混合整粒,在温度25℃、湿度30%条件下,以旋转式压片机压制成片。4泡腾片质量标准研究薄层鉴别显示,化橘红维C泡腾片在紫外灯(365nm)下检视,与柚皮素、芹菜素对照品Rf值相同位置均有显相同颜色的荧光斑点。泡腾片的片重差异在-3.91%～3.89%之间,符合药典规定的±5%限度,片重差异检查合格。4批泡腾片的崩解时限均符合药典规定5分钟以内崩解完全的的要求,本片剂崩解时限检查合格。根据UPLC法测定4批泡腾片制剂中柚皮素含量的结果,其柚皮素含量应为5.4±0.5mg/片；采用国家颁布的保健食品检验指南中规定的总黄酮测定法测定泡腾片中总黄酮含量,其总黄酮平均含量为14.13%。5抗氧化功能评价DPPH法体外评价抗氧化性结果表明,优化工艺中化橘红提取物抗氧化活性清除自由基的能力(抑制率高达26.24%)显著高于优化前的化橘红提取物(抑制率为16.13%)。灌胃化橘红维C泡腾片45d后,小鼠血中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)舌力结果表明,在高剂量组与阳性对照组中,与正常对照组SOD活性差异具有显著性(P<0.05),与正常对照组GSH-Px活性差异具有显著性(P<0.01)；在中剂量、低剂量组中,与正常对照组GSH-Px活性差异具有显著性(P<0.05)。灌胃溴代苯油造模后,小鼠肝脏中MDA、LPO含量较正常对照组分别增加0.73±0.22nmol/mL、0.68±0.31μmol/gprot,其差异具有极显著性(P<0.01)。与模型组相比,高剂量组可有效抑制溴代苯引起的肝脂质过氧化,使MDA、LPO含量降低,其差异具有极显著性(P<0.01),中剂量与低剂量组可降低LPO含量,其差异具有极显著性(P<0.01)；同时,中剂量组的SOD活性与模型组对比具有显著性差异(P<0.05),高剂量组和中剂量组GSH-Px活性,与模型组对比具有极显著性差异(P<0.01),说明适量的化橘红维C泡腾片有助于增强小鼠机体清除自由基的能力,具有一定的抗氧化作用。结论：1经过科学配方配伍后的保健食品组方科学合理,立项依据符合现代医学理论和中医传统养生理论,预期达到的保健功能具有科学性。2从原药材、提取物到泡腾片制剂进行多方位的质量控制,外观性状、薄层色谱、崩解时限及有效成分含量测定等质控指标的综合应用,可有效保证所研发的产品的质量控制水平。3首次使用酶法对化橘红提取物进行脱苦工艺研究,所获得的化橘红提取物显著改善了传统化橘红提取物甚苦的口感,并能增强其抗氧化功效,可应用于化橘红食品和保健食品制备。所选用的泡腾片剂型,具有口感清凉、崩解迅速,服用方便,便于保存和携带的特点。所研产品是一种效果确切、富具特色的化橘红保健食品。4制定化橘红维C泡腾片质量标准为具体数据,该标准可以有效地控制该泡腾片的质量。5化橘红维C泡腾片能有效抑制溴代苯导致的肝脂质过氧化,使小鼠血清、肝脏中SOD和GSH-Px活力明显升高,肝脏中MDA、LPO含量显著降低,提示合理服用化橘红维C泡腾片,增强清除自由基的能力,具有良好的抗氧化作用。