炎症被认为是导致肿瘤发生和发展的重要因素之一,研究证明长期存在于局部的炎症通过DNA损伤、抵抗凋亡等机制诱导肿瘤的发生,并能够进一步募集大量免疫细胞侵润,从而形成肿瘤微环境继续促进肿瘤发展,但目前对于引发炎症导致肿瘤发生和发展的相关机制还存在许多疑问。近来的研究表明表达于肿瘤细胞中的Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)可能是炎症与肿瘤之间的一个关键连接点。Toll样受体是在进化上十分保守的一类跨膜受体,主要表达于免疫相关细胞及上皮细胞,通过识别病原相关模式分子(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),在机体先天免疫应答、组织修复及组织损伤引发炎症反应等过程中发挥着至关重要的作用。最初,TLRs被认为只表达于免疫相关细胞及上皮细胞,参与活化天然免疫应答和特异性免疫应答。近年来很多的研究发现TLRs稳定表达于多种肿瘤细胞表面,可能通过多种机制参与了肿瘤的发生及发展。目前大量的研究只关注TLRs与肿瘤形成的关系,然而亦有研究指出TLRs启动的炎症反应还参与形成肿瘤微环境,与肿瘤部位的免疫细胞浸润、良性肿瘤细胞恶性转化和转移等过程密切相关。骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是一种磷酸化的糖蛋白,能够与转移相关细胞表面的整联素受体αvβv和CD44v受体结合,介导恶性肿瘤细胞的粘附、迁移和侵袭。骨桥蛋白基因经过选择性剪接,产生N端存在差异的三种剪接突变体,分别命名为OPN-a,OPN-b和OPN-c。其中OPN-a是未发生选择性剪接产生的全长OPN,亚型OPN-b缺少外显子5,OPN-c缺少外显子4。随着研究的深入,发现OPN-c在多种恶性肿瘤细胞及组织中高水平表达,相比OPN-a、OPN-b,与恶性肿瘤的表型形成及转移的关系更为密切,并认为OPN-c可作为多种恶性肿瘤的诊断标志。然而,起始OPN表达介导肿瘤转移的上游分子机制尚不十分清楚,有待作进一步的研究。Toll样受体信号引发炎症是调控肿瘤发生、演进的一个上游分子事件,OPN则作为一个发挥具体作用的功能分子介导肿瘤细胞转移。那么,TLRs信号与OPN两者之间是否存在一定的联系,TLRs能否影响OPN表达水平进而作用于肿瘤转移呢?在以上研究背景和假设的基础上,我们在本课题中选取低转移卵巢癌细胞株HO-8910和从HO-8910分化而来的高转移卵巢癌细胞株HO-8910PM为研究对象,首先在mRNA水平检测了TLR1-TLR9在两种肿瘤细胞中的表达。逆转录PCR结果:除TLR1、TLR2和TLR8外,在两株细胞中均检测到其余6种TLRs mRNA表达。由于TLR4 mRNA在两株细胞株中均高水平稳定表达,故选取TLR4作为研究对象以LPS为TLR4激活剂,进一步探讨TLR4信号对OPN表达水平以及肿瘤转移能力间的作用。随后的体外肿瘤细胞增殖及转移实验,证明TLR4信号促进了肿瘤细胞增殖、转移和侵袭活力,与HO-8910相比HO-8910PM表现出更强的增值及转移活力。利用实时定量PCR与免疫印迹技术,我们发现LPS激活的TLR4信号上调三种OPN亚型及OPN-32kDa的表达,且HO-8910PM中OPN的表达水平显著地高于HO-8910,这暗示OPN高水平表达与增强肿瘤细胞恶性转化表型具有相关性。通过中和抗体封闭OPN后,由LPS刺激导致的细胞增殖及转移活力等表型明显的得到缓解,印证了OPN在LPS促进肿瘤细胞增殖及转移过程中的重要作用。综合以上结果,我们认为TLR4信号通过上调OPN的表达是炎症进而促进肿瘤细胞的转移的一条潜在途径。综上,本研究首先通过检测转移能力相异的两株细胞中TLRs的表达情况,确定TLR4研究对象继续深入探讨;然后用LPS激活TLR4通路,检测OPN的诱导表达情况;同时结合体外肿瘤细胞增殖及转移活力相关实验,明确OPN水平与肿瘤转移表型间的联系;最终通过中和抗体抑制OPN功能,确定TLR4信号上调OPN表达对细胞恶性转化具有重要的作用。本研究对加深了解炎症促进良性肿瘤恶性转化有重要的价值,亦是对肿瘤细胞中TLRs信号调控的下游功能因子网络一个新补充,同时为以OPN作为预诊分子的理论提供更多的科学认识。