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目的:本研究以肝癌HepG2细胞为靶细胞,探讨天然钠钾ATP酶抑制剂华蟾酥毒基和钠钾ATP酶α1亚单位基因沉默对肝癌HepG2细胞生长和细胞周期的影响,观察钠钾ATP酶下游相关信号途径分子基因的表达变化,探讨钠钾ATP酶α1亚单位在肝癌细胞生长调节中的作用。方法:（1）靶向钠钾ATP酶α1亚单位shRNA质粒表达载体的构建与筛选:设计、合成靶向人钠钾ATP酶（Na+/K+-ATPase）α1（ATP1A1） mRNA的3对DNA序列,分别插入Pgenesil-3中构建编码ATP1A1的短发夹RNA（shRNA）质粒表达载体shRNA-ATP1A1（ATP1A11,ATP1A12和ATP1A13）,经限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定确认。筛选并确定最佳细胞接种量及重组质粒转染量,半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫细胞荧光检测Na+/K+-ATPaseα1表达变化,从而确定沉默效果最明显的shRNA-ATP1A1。（2）MTT法和流式细胞术检测沉默效果最明显的ATP1A13和华蟾酥毒基对HepG2增殖活性和细胞周期的影响。（3）形态学观察:倒置光显微镜观察细胞形态结构改变;荧光显微镜下观察DAPI染色后的细胞形态。（4）RT-PCR检测ATP1A13和华蟾酥毒基作用于HepG2细胞不同时间,CDK2,PCNA,cyclinA,p21,p53,c-src,Raf1,MEK1,MEK2,ERK,c-Myc mRNA的表达变化。（5）实时定量荧光PCR检测ATP1A13和华蟾酥毒基作用于HepG2细胞24 h后各基因mRNA的表达变化。（6）Western blot检测ATP1A13和华蟾酥毒基对CDK2,PCNA,CyclinA,p53,c-Src,ERK,p-ERK和c-Myc蛋白表达的影响。结果:（1）质粒构建及筛选:构建的质粒表达载体酶切鉴定均可扩增出预期条带,经测序符合设计要求,构建成功。ATP1A12和ATP1A13对所转染的HepG2细胞中Na+/K+-ATPaseα1 mRNA和蛋白表达均有抑制作用,其中ATP1A13最为明显。实时定量荧光PCR检测ATP1A13敲低HepG2 Na+/K+-ATPaseα1 mRNA呈时间依赖性,72 h后表达降低约90 %。（2）生长抑制作用:ATP1A13和华蟾酥毒基均可抑制HepG2细胞生长。转染试剂和阴性质粒转染对HepG2细胞的生长抑制不明显。华蟾酥毒基对HepG2细胞的生长抑制作用呈时间浓度依赖性,高浓度的华蟾酥毒基（10μmol/L）对细胞抑制显著,而低浓度（0.01μmol/L）对细胞的增殖抑制作用明显降低。经直线回归计算,24 h,48 h,72 h IC50分别为（3.039±0.371）、（0.758±0.102）和（0.133±0.028）μmol/L。（3）细胞周期改变:ATP1A13和华蟾酥毒基都可使HepG2细胞周期发生S期阻滞。转染48 h和60 h,S期细胞由正常的（27.60±1.98）%升至（39.4±2.04）%和（50.2±1.95）%。华蟾酥毒基作用于HepG2细胞6、12、18和24 h,S期细胞比例分别为（32.51±2.34）%、（40.28±1.89）%、（55.27±1.98）%和（67.28±1.92）%,均高于正常对照。ATP1A13和华蟾酥毒基作用后,HepG2细胞中细胞周期相关蛋白（CDK2,CyclinA,PCNA）的含量减少,细胞周期负调控因子p21CIP1表达上升。（4）细胞形态学改变:HepG2为贴壁生长型细胞,ATP1A13和华蟾酥毒基作用后,细胞出现明显的形态学变化。ATP1A13转染24 h,部分细胞变圆肿胀,贴壁状态不好;转染36 h,细胞形态不规则、排列紊乱有少量漂浮细胞;转染48和60 h时,绝大部分细胞出现空泡现象,细胞间失去正常的接触抑制,细胞碎片增多;转染72 h时,细胞大都破碎、死亡。1μmol/L华蟾酥毒基作用6 h即可见有细胞肿胀变圆;随着作用时间的延长,肿胀细胞逐渐增多;华蟾酥毒基作用24 h后,细胞间间隙变大,细胞破碎变形、排列紊乱。荧光显微镜下可见ATP1A13转染和华蟾酥毒基作用后部分细胞呈现形态不规则,核染色质凝集,核膜破裂等细胞形态,且随着作用时间的延长,上述改变更加明显。（5）ATP1A13和华蟾酥毒基对HepG2细胞信号途径分子基因mRNA表达的影响:ATP1A13转染HepG2细胞后,MEK1,MEK2,ERK和c-Myc mRNA的表达下调;p53,c-src和Raf1 mRNA的表达显著下调。华蟾酥毒基作用后,HepG2细胞Raf1和ERK mRNA的表达上调;MEK1和c-Myc mRNA的表达显著上调;p53和c-src mRNA的表达下调。（6）ATP13和华蟾酥毒基对HepG2细胞信号途径分子基因蛋白表达的影响:ATP1A13作用于HepG2细胞后,与对照组细胞相比,c-Src,ERK,p-ERK和c-Myc蛋白表达下调,p53蛋白的表达显著上调。华蟾酥毒基可以下调HepG2细胞c-Src,p-ERK和c-Myc蛋白的表达,上调p53的表达。达载体,并筛选出抑制效果最佳的表达载体ATP1A13。（2）ATP1A13和华蟾酥毒基作用于HepG2后,可以降低周期蛋白复合体（CyclinA/CDK2/PCNA complex）的含量,并上调p21CIP1的表达,使细胞周期发生S期阻滞。（4）应用ATP1A13和华蟾酥毒基处理HepG2细胞,可以上调细胞内p53蛋白的表达,下调c-Src和p-ERK的表达,并降低c-Myc的水平,促使细胞增殖受抑。（5）ATP1A13作用于HepG2细胞,可以在转录水平抑制Raf1/MEK1/2/ERK途径,细胞内p-ERK表达下调,抑制细胞增殖。（6）钠钾ATP酶α1亚单位基因沉默和钠钾ATP酶抑制剂作用于肿瘤细胞的机制并不完全相同,对其作用机制的研究,可以为更好地研究药物和RNA干扰技术治疗肝细胞癌奠定一定基础。