研究背景： 动脉粥样硬化引起的颈动脉狭窄是缺血性脑卒中的一大重要危险因素.颈动脉内膜切除(Carotid endartererectomy,CEA)已成为目前公认的治疗颈动脉狭窄、降低缺血性脑卒中危险性的方法;颈动脉支架植入(Carotid artery stenting,CAS)是近年开展的介入治疗.但不论是手术还是介入治疗,均可能引起再狭窄,尤其是在原有的血管疾病基础上更容易出现,从而影响了手术效果.在冠状动脉狭窄的介入治疗中,虽然药物支架降低了再狭窄发生率,但是却延缓内膜修复,从而增加了致死性迟发性支架内血栓的危险性.为了降低发生缺血性脑卒中的危险性,防治颈动脉粥样硬化以及CEA和CAS术后再狭窄成为重要的研究课题. 新生内膜形成或内膜增生是动脉粥样硬化和再狭窄的重要病理标志,主要由增生并迁移至内膜的平滑肌细胞、炎性细胞和细胞外基质组成.内皮是组成血管内膜的单层内皮细胞层,覆盖于血管内表面,维持血管的结构完整和正常功能.内皮细胞功能障碍作为血管性疾病的独立危险因素,也是促成内膜增生的重要原因.一氧化氮(NO)缺乏是内皮细胞功能障碍的一个重要特征.内皮细胞合成的NO是维持内皮正常功能的决定性物质,它能够调节血管张力和血压,并具有抗炎、抗血栓、抗细胞增生等多重抗动脉粥样硬化的作用.NO由NO合成酶(NOsynthase,NOS)生成.通过NO供体补充或NOS转基因的方法增加NO生物活性,能够防止动脉内膜增生,而通过eNOS基因敲除减少NO生成,加重动脉内膜增生.尽管eNOS转基因治疗是行之有效的,但是NO水平还受到其他多因素影响,动脉内膜、中膜增生是多因素参与的病理过程.四氢生物蝶呤(Tetrahydrobiopterin, BH4)是NOS合成NO的重要辅因子.BH4充足时,NOS接受并储存来自NADPH的电子,在底物左旋精氨酸和O2存在时,将电子转运给左旋精氨酸而使后者被氧化成左旋胍氨酸,同时伴随NO产生.而BH4水平不足或生物利用度下降时,激活的NOS不能催化左旋精氨酸氧化生成左旋胍氨酸和NO,但是仍然能够接受来自NADPH的电子并将电子传递给另一底物O2,结果主要终产物是O2-,而不是NO,这种状态下的eNOS存在功能不全,被称为eNOS脱耦联.NO水平降低和氧应激均加重动脉内膜增生.Ⅰ型三磷酸鸟苷环化水解酶(Guanosine 5-triphosphate cyclohydrolase Ⅰ,GTPCH)是BH4从头合成过程中的第一限速酶,在体内体外均通过影响BH4的合成对NOS功能起着重要的调节作用.但是内皮特异性GTPCH对动脉新生内膜形成的作用目前尚不完全清楚. 血管平滑肌细胞增殖并分泌细胞外基质,形成新生内膜.骨髓是新生内膜平滑肌细胞的重要来源.一般情况下,骨髓干细胞处于静息状态,但是特定的信号可以动员骨髓干细胞进入血液循环,向病变血管部位募集,分化为内皮细胞或平滑肌样细胞,并在局部增殖修复病变.但是,骨髓干细胞是通过什么机制动员、募集和分化的,目前尚不完全清楚.血小板源性生长因子-β受体(Platelet-derived growth factor-β receptor,PDGFR-β)参与了骨髓细胞向平滑肌祖细胞分化的信号转导过程.基质细胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor-1,SDF-1)在介导骨髓源造血干细胞的动员、分化中起着至关重要的作用,促进骨髓及循环中的祖细胞向损伤血管聚集、分化为平滑肌细胞产生新生内膜.eNOS缺陷通过增加局部SDF-1表达促进平滑肌祖细胞损伤血管的聚集,从而加重颈动脉内膜增生.eNOS功能不全也存在于BH4缺陷时,如高血压、糖尿病、高酯血症等疾病状态下.但在BH4缺陷时骨髓细胞对颈动脉新生内膜形成的影响尚不清楚. 基于以上所述,本课题内皮特异性高表达GTPCH的转基因小鼠,在颈动脉内皮剥除小鼠模型上探讨内皮特异性GTPCH高表达对新生内膜的影响.另外,选择GTPCH缺陷的hph-1小鼠,探讨骨髓细胞治疗对颈动脉血流动力学改变所引起的新生内膜形成的影响. 第一部分 GTPCH高表达对新生内膜的影响研究目的探讨内皮特异性GTPCH高表达及内源性BH4对内皮损伤所致颈动脉新生内膜形成的影响. 研究方法： 采用野生型C57BL/6和内皮特异性GTPCH转基因小鼠,建立颈动脉内皮剥除模型,采用血管等长张力记录的方法分析内皮依赖性和非依赖性颈动脉舒张功能和基础NO释放,采用组织学方法分析动脉损伤14天和28天后血管形态学特征,采用高效液相色谱技术测量GTPCH酶活性和BH4水平.结果1. 动脉内皮剥除10天和28天后,再生的内皮细胞存在功能障碍. 2. 内皮特异性GTPCH高表达抑制内皮剥除所导致的颈动脉内膜和中膜增生. 3. 内皮特异性GTPCH高表达使动脉GTPCH酶活性上调,有效的增加了动脉BH4水平. 4. 内皮特异性GTPCH高表达有促进颈动脉内皮剥除后基础NO释放的趋势. 第二部分　外源性骨髓细胞对GTPCH缺陷小鼠新生内膜的影响研究 　　目的：探讨外源性骨髓细胞治疗在GTPCH缺陷时对颈动脉新生内膜形成的影响. 研究方法： 采用GTPCH基因变异的系统性GTPCH缺陷hph-1小鼠,用HPLC测量动脉BH4水平.分离WT小鼠骨髓单核细胞,培养4天后用于细胞治疗.在hph-1小鼠建立颈动脉结扎模型,在建立模型的当天和24小时后静脉输注1×106培养的骨髓细胞,14天后进行形态学分析和检测平滑肌细胞面积,7天和14天后检测颈动脉SDF-1(促进平滑肌祖细胞募集和分化的重要因子)表达,对于被输注的细胞检测PDGFR-β(与平滑肌祖细胞募集分化有关,表达于早期的平滑肌祖细胞)表达. 　　 结果： 　　1. hph-1小鼠GTPCH基因缺陷导致动脉BH4水平下降. 2. 颈动脉永久性结扎诱发BH4缺陷的小鼠动脉内膜、中膜增生. 3. 外源性骨髓源细胞静脉输注加重BH4缺陷小鼠内膜增生,并增加内膜的平滑肌细胞面积. 4. BH4缺陷小鼠损伤的动脉表达SDF-1,而被输注细胞表现为部分PDGFR-β+(提示平滑肌祖细胞存在的可能性).提示在BH4缺陷时,病变局部SDF-1可能参与促进PDGFR-β+细胞向病变处募集、分化为平滑肌细胞,从而加重病变. 结论： 1. 内皮特异性GTPCH高表达抑制了颈动脉内膜损伤所致内膜和中膜增生,其机制可能与内皮BH4水平增加和NO释放有关.从一个侧面了解动脉粥样硬化及颈动脉内膜剥除术后再狭窄的机制,提示新的防治方向. 2. 外源性骨髓细胞输注加重GTPCH缺陷小鼠颈动脉内膜增生,增加内膜的血管平滑肌面积,可能与病变局部SDF-1表达,募集PDGFR-β+细胞有关.提示在存在BH4缺乏的疾病,骨髓细胞治疗有加重病变的可能,临床上应引起重视.