目的 一氧化碳(CO)作为一种无色无味的气体，由含碳物质的不完全燃烧所释放，其毒性早已为人们所知。然而，随着生活水平的提高，一氧化碳中毒却没有相应的下降趋势，在许多国家(无论是发展中国家还是发达国家)，与中毒相关的死亡50％以上由一氧化碳所引起。CO中毒除有较高的死亡率外，还有较高的致残率。CO对人体重要器官脑和心损害极大，中毒病人经及时治疗仍有高达23-47％发生迟发性神经精神后遗症(delayed neuropsychologic sequelae，DNS)。轻者头痛，失眠，记忆力减退，重者发展成脑病或精神病。由于CO中毒受害者多为青壮年，由此引发的劳动能力丧失，生活质量下降，巨大的医疗花费等又构成严重的社会问题。 鉴于CO中毒严重威胁人民的生命健康，许多学者对其进行了研究。由于损害涉及到脑，许多实验难以在人体上进行，只能采取间接的方法或利用动物。至今CO引起神经精神损害的机制不清。动物研究发现，CO中毒后脑内有脂质过氧化和白细胞粘附增多的情况；大鼠脑内即早基因表达增多；CO阻碍组织对氧的利用，抑制细胞色素C氧化酶活性等。死亡病人解剖发现有脑白质脱髓鞘坏死，脑皮质海绵状坏死以及海马坏死等。国内研究基本都是采病人外周血做一些指标的测定，CO中毒脑损害仍有许多问题需要探讨。 我国也是CO中毒高发区。北方冬季寒冷，门窗紧闭，仍有许多民居用煤取暖。近年因燃气热水器引发的CO中毒也常有发生。1994年中国医科大学第一临床医院急诊科调查显示，急性CO中毒为第二位常见中毒，而死亡人数居第一位。 CO中毒的治疗主要是通过供氧以促进CO从血红蛋白解离，改善组织氧供。高压氧(HBO)治疗始于上世纪60年代末期。HBO用于CO中毒急性期效果已经得到公认。研究认为，HBO可改善线粒体的有氧代谢，抑制脂质过氧化和中性粒细胞粘附于脑血管而引起的损害。但HBO对迟发 性神经精神损害的效果至今仍有争议，HBO的作用机制仍未完全阐明。对 于其他抑制脑损害的治疗途径，目前研究甚少。 本实验利用CO中毒小鼠模型，观察脑内形态学（超微结构厂凋亡，自 由基释放与清除，细胞因子变化等，并设立高压氧治疗组，观察其对上述指 标的影响。为进一步探讨CO中毒脑损害机制的研究提供实验依据；也为 高压氧治疗的理论基础，临床上引人基因治疗，桔抗剂治疗等提供依据。 方 法 1．建立CO中毒小鼠模型 将小鼠放人自制SL染毒瓶中，密闭。瓶内预先放置碱石灰，可吸收呼 吸产生的COp通过导管通人CO气，令小鼠于瓶内吸人浓度为2500－ 3000ppm的CO气50－60min至昏迷。每15分钟采样一次50ITil，用快速检 测管测定瓶内CO浓度和氧浓度，使之维持于规定浓度。 2．流式细胞术测定小鼠脑内Bcl－2，Bax，P53的表达以及凋亡细胞数 ①用网搓法制备单细胞悬液 lx 10VInl。一抗分别用 Bcl－2，Bax或 p53 ／J’鼠IgG单抗，二抗用FITC山羊抗小鼠均 对细胞悬液进行标记。在 流式细胞仪上以488urn t激光激发，以平均荧光强度代表基因蛋白表达 量。②同法制备单细胞悬液进行PI染色。在流式细胞仪上以488urn t激光 激发，＞61O urn滤光镜检测。测定每样本计数＊，皿O个细胞，经0…SS七 软件分析细胞数DNA分布图，计算正常二倍体峰前AP峰曲线下面积占整 个分布曲线下面积百分比，即为凋亡细胞所占比例，用百分数表示。 3．透射电镜观察超微结构 取大脑，小脑，海马区组织各约 lmm＼ 2．5％戊二醛及 1％OSO。固定， EPON812环氧树脂包埋，LKB－V超薄切片机（500－1000A）切片，切片以 醋酸铀柠檬酸铅双重染色，用H—600透射电镜观察。 4．分光光度法测定血脑屏障通透性 取已注射二％EB生理盐水的小鼠脑匀浆，离心取上清．用分光光度计 在70Inm处测吸光度，根据EB含量一吸光度回归方程计算脑组织EB含 量。 5．ELISA法测定 TNF－a、IL－lp、IL－8和 IL－10 ·2· 取脑组织匀浆，低温离心卜t℃，120009）取上清，采用双抗体夹心ELISA法进行测定。根据标本OD值在各自的标准曲线上查出各种细胞因子含量。 6．分光光度法测定小鼠脑内NO、NOS、MDA、SOD、GSH－Px、CAT 脑组织匀浆离心取上清。用＊U—640型分光光度计在546urn（NO人401urn和 421urn（NOS），532urn 〔MDA），550urn（SOD），405urn（CAT），412nm（SH－Px）处，比色测各管吸光度值。 结 果 ＊CO中毒小鼠脑内h－2，P53人ax表达及细胞凋亡增加，高峰分别为中毒后 lh，3天，7天；急性 CO中毒可使小鼠脑细胞凋亡，发生超微结构改变人O中毒后应用高压氧治疗可以减少细胞凋亡（与中毒组比较有显著差异八HBO抑制脑细胞超微结构的改变；急性CO中毒可使小鼠血脑屏障通透性增高，中毒前15分钟或中毒后30分钟给予L－NAME均可减轻CO中毒对血