白背飞虱与灰飞虱的微卫星开发及种群遗传结构研究

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白背飞虱Sogatella furcifera (Horvath)与灰飞虱Laodelphax striatellus (Fallen)同属半翅目,飞虱科。这两种飞虱是目前为害我国水稻生产的最主要的两种飞虱科害虫。白背飞虱被认为有远距离迁飞习性,一直以来对其确切的虫源地和迁飞线路尚存争议,但该研究因为缺乏有效的分子标记尚处于停滞阶段。而灰飞虱在我国一般被认为是本地虫源,虽然国外不少研究认为其具备远距离飞行能力,但是对于其迁移能力的分子遗传学研究却很少。因此,利用有效的分子标记手段对这两种飞虱不同的地理种群进行分析,能够从遗传学的角度揭示这两种飞虱可能的迁飞路径,并反映出它们在迁飞过程中种群遗传结构的动态变化与遗传特性。在目前的种群遗传学研究中,分布于生物核基因组中的微卫星标记与分布在线粒体当中的细胞色素氧化酶亚基基因是较为常用的两种分子标记手段。利用微卫星标记和线粒体DNA序列能够研究种群多样性、种群迁移、种群结构等一系列种群遗传学内容。因此,本研究中,我们使用了两种分子遗传标记:微卫星及线粒体COIl基因对白背飞虱和灰飞虱分别进行了微卫星开发和基于两种标记的种群遗传学研究。在基于微卫星标记的研究中,我们首先通过挖掘两种飞虱转录组数据开发EST-SSR的方法分别对白背飞虱和灰飞虱两种飞虱成功开发了19个和7个微卫星分子标记。在此基础上,我们成功构建了19个白背飞虱微卫星标记的荧光多重PCR体系。并以这些新的微卫星位点为基础进行了我国5个地理种群的白背飞虱种群和3个地理种群的灰飞虱遗传学的初步研究,为进一步进行两种飞虱的种群遗传学研究和迁飞路径研究打下基础。获得以下主要结果:(1)本研究自白背飞虱的Short Read Archive数据库下载白背飞虱转录组数据,通过对转录组数据拼接处理,设计663引物并筛选出了220对引物进行PCR验证,最终筛选得到了19个多态性较好的白背飞虱微卫星标记。并依据同样的方法开发了7个灰飞虱微卫星位点。(2)对19个新开发的白背飞虱微卫星位点进行荧光多重PCR组合筛选、并对多重PCR反应体系和反应条件进行优化。最终将19个多态性较好的微卫星位点设计为4组不同的多重PCR组合,每组中含有4-7个微卫星位点。该体系的建立大大提高了本研究中微卫星的分型效率。(3)通过5个白背飞虱地理种群对新开发的19对微卫星引物进行扩增检测。共检测到156个等位基因,每个位点具有3-14个等位基因,平均等位基因数为6.8个。5个种群的表观杂合度0.105-0.766之间,预期杂合度在0.099-0.783之间。这19个微卫星多态性水平较高,每个种群各位点的平均等位基因丰富度在4.4-5.0之间。总体FST有0.003,显示出5个种群之间的分化程度很小。只有文山与龙岩种群之间分化相对较显著,FST=0.0073,但所有的FST值均没有达到显著水平。(4)通过3个灰飞虱地理种群对这7个微卫星位点的评测发现这7个微卫星多态性较好。平均每个位点等位基因数介于5-14个,平均为9个。其中哈尔滨种群平均为9个,上海种群等位基因数均值最高,为9.7,而龙岩种群均值为8.3,在三个种群当中最低。三个种群的表观杂合度和预期杂合度分别在0.542到0.971和0.604到0.876之间。这7个位点在129个研究个体中都能成功地扩增并具有清晰的带型。另外,在基于线粒体分子标记的研究中,我们利用一段线粒体COII基因序列对中国26个灰飞虱地理种群共计1144个灰飞虱个体展开种群遗传多样性和种群遗传结构的研究,得到相关的结果与结论如下:(1)本研究所使用的线粒体COII片段长度为650bp,共有42个多态性位点,其中简约信息位点13个,单一多态位点27个。所有序列没有插入和缺失,并且三个基因都表现出碱基偏倚性,A+T含量明显高于G+C含量,符合昆虫线粒体DNA碱基组成。全部序列可被分类为46个单倍型,其中11个为共享单倍型,35个为私有单倍型。单倍型多样性较好,在0.22与0.82之间,平均为0.596;而核酸多样性较差,在0.037%-0.222%之间,平均0.132%。东北地区的灰飞虱多样性较差,平均每个种群有5个单倍型,其中最差的是牡丹江种群,仅有2个单倍型,并且没有私有单倍型。(2)种群间分化指数FST值在绝大多数种群间都不显著,说明各种群之间总体分化较弱。但值得注意的是,黑龙江的牡丹江种群以及哈尔滨种群与其他种群分化程度较强,FST值显示这两个种群与其它种群有较显著的差异,部分FST值在0.1-0.4之间。距离隔离效应分析结果显示,虽然相关系数很低,但种群的分化程度与地理距离显著的正相关性。中性检测的结果发现总体Tajima’s D和Fu and Li’s D值都为负显著,说明群体可能发生过近期的种群突然扩增。AMOVA分析表明,26个种群之间的差异主要来自于种群内部。
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