高温环境下，当人体维持热平衡的汗液蒸发降温超过环境中的最大蒸发量时，体内热量蓄积，下丘脑调节热蓄积和热消散平衡失败，人体的热平衡被破坏，体核温度持续升高，常导致中暑高热、虚脱，出现头痛、惊厥、昏迷等症状。其损伤过程、损伤机制、治疗策略和方法等，一直为人们所关注，希望通过对这些问题的深入探讨，能进一步解决热射病的预防、治疗、康复等诸多问题，对其引起的热应激反应的研究，将具有重要的卫生学及预防医学意义。 从低等动物细菌到高等动物人类，受高温作用后均可发生热应激反应，此反应的特点是选择性合成一组多肽——热应激蛋白，它是一种保护机体的蛋白。众所周知，人对热可产生适应，热适应后可缓解其引起的生理紧张，提高耐热能力，但热适应又是有一定限度的，超过限度后可出现热损伤，故研究热引起的机体生理、生化反应，探索热应激过程中热应激蛋白的作用在科研及临床上具有积极的意义。热应激反应的结果是高温下热应激蛋白的合成增加，组织细胞出现坏死、凋亡及一系列的形态学及分子水平改变，热应激蛋白合成增加反过来又对热应激反应的损伤性结果具有保护作用。在热应激损伤的过程中，受损神经元内出现一系列亚细胞和分子水平的病理变化，造成细胞膜、细胞器和DNA损伤，其中DNA损伤可能既是多种致伤因素作用的结果，也是细胞内产生新的变化和损伤的原因，研究表明DNA损伤引起的细胞凋亡在热应激损伤的病理过程中占有十分重要的作用，是热应激损伤引起凋亡的主要原因之一。神经元凋亡是一种可调控的细胞死亡方式，受到一系列蛋白质的调控。因此详细了解热应激损伤的细胞的生物学特性的改变及 第四军医大学硕士学位论文凋亡情况，可以为防止神经元凋亡，寻找热应激损伤的保护性方法和技术提供有益的思路。目前的研究表明高温可导致多种细胞凋亡，而在体外培养的神经元上，这方面的报道较少。本研究旨在建立体外培养神经元高温损伤模型的基础上，探讨高温损伤后神经元的形态、凋亡及细胞活力等生物学改变，并初步探讨预热对体外培养神经元的保护作用，希望能为高温损伤的机制及治疗做一些有益的基础工作。 本实验在我室首先建立了小鼠大脑皮质神经元高温损伤模型，在此基础上，将培养的皮质神经元分为未经高温处理的对照组、高温处理的实验组，采用倒置显徽镜、1刃E染色方法、DNA聚合酶一I(eno、v大片段介导的生物素标记的山订P末端标记方法(租eno、v法)等方法，观察对照组及处理组各温度下损伤的神经元的形态学变化，检测DNA断裂损伤情况。本次实验所得结果如下: [l]光镜观察:在倒置显微镜下，正常神经细胞经胰蛋白酶消化后呈圆形。接种培养后10h，胞体增大呈圆形或椭圆形，分散的神经细胞开始贴壁。1 6h贴壁细胞增多并有突起长出，胞体呈梭形或三角形，双突起多见，突起末端可见生长锥。24h后大部分神经细胞贴壁，突起延长，开始相互连接。3天后细胞胞体进一步增大，突起继续增长，相互连接成神经网络。7天时对照组细胞光晕明显，胞体饱满并聚集成团，细胞团间有粗大的突起并相互连接，神经网络稠密。处理组高温后漂浮细胞增加，神经细胞数目减少，神经网络稀疏，有的细胞突起漂浮，有的失去突起，呈圆形或椭圆形。这种形态改变温度越高越明显。39℃时部分细胞坏死，胞体碎裂。42℃大部分细胞出现坏死，胞体碎裂，突起漂浮或消失。 [2] HE染色显示:光镜下观察，细胞质呈淡红色，细胞核呈淡蓝紫色。未经高温处理组神经元形态正常，胞核清晰可见，高温处理后部分细胞出现形态变化，胞体皱缩或肿胀，随着处理温度的增高，神经元胞体变小，胞质浓缩，核染色质凝集，突起变短，变细，42℃高温处理后细胞数量明显减少。 [3刃~法检测显示:未经高温处理的对照组神经元经习enow法检测的结果为69.54士1 .70，39℃时达高峰133.40士4.49，而后又逐渐 第四军医大学硕士学位论文降低。经过方差分析，不同温度平均灰度不同(p<0.01)，各组与对照组比较有差异。未经预热处理的对照组神经元37℃经犯enow法检测的结果为70.16士0.91，39℃时达高峰133.“士4.41，而后又逐渐降低。实验组神经元平均灰度值明显较对照组为低，其最高峰值为1 10.86士2.94。经过方差分析，不同温度点平均灰度不同(卜0.01)，各组与对照组比较有差异。 [41 MTr比色法的结果:未经高温处理的对照组神经元经州叮T比色法检测的吸光度为0.48士0.似随着温度的增高，检测的细胞吸光度明显降低，在42℃时达最低，为0.21士0，02。 本次实验结论如下: 【11本实验培养了小鼠原代的皮质神经元，应用台盼蓝对细胞的活性进行评估，经光镜、HE染色发现经高温处理后的神经元存在明显的形态改变。 [2]根据DNA聚合酶I大片段的功能和原位杂交的原理，首次用粗enow法在高温处理后的神经元上证明了凋亡的存在，其凋亡高峰在39℃，达到峰值的幻enow阳性细胞中多数可能为DNA单链断裂的细