海洋生态系统是地球上最重要的生态系统之一,海洋细菌在海洋生态系统和生物地球化学循环中起重要作用。海洋中的富营养细菌,生长迅速,多样性高,但是对于富营养菌是如何分化的,尚缺少系统研究。假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)是一个海洋特有的细菌属,目前包含39个种。该属菌株广泛分布于全球不同海域,并且在许多样品中丰度很高。根据表型和系统发育关系,该属菌株可以分为产色素和不产色素两大类群。其中,产色素菌株具有抗菌溶菌、抗污、抑藻溶藻等多样的生物活性,而不产色素菌株则能够产多种胞外酶,并且对极端环境表现出较强的适应能力。因此,这两个类群在海洋生态系统及海洋物质循环中很可能具有不同的生态功能。但是目前对于该属菌株的生理性质和生态功能的多样性水平,以及其遗传基础和代谢机制,尚不清楚。此外,已有研究显示该属菌株TAC125和SM9913都具有两条染色体,这与已知的多数细菌不同,但是目前对于该属基因组的结构特点、复制机制等,尚缺乏研究。本论文以该属细菌为研究对象,通过收集系统分类学的模式菌株,开展基因组测序和系统的比较基因组学研究,取得了以下研究成果。(一)完成了该属26个种的模式菌株的全基因组测序本论文收集了假交替单胞菌属26个种(占已发现种的2/3)的系统分类学的模式菌株,包括15株不产色素菌株和11株产色素菌株。不产色素菌株分别为:P.agarivorans、P.aliena、P.arctica、P.carrageenovora、P.espejiana、P.issachenkonii、P.lipolytica、P.marina、P.mariniglutinosa、P.nigrifaciens、P.paragorgicola、P.prydzensis、P.tetraodonis、P.translucida、P.undina。产色素菌株分别为 P.aurantia、P.citrea、P.flavipulchra、P.luteoviolacea、P.peptidolytica、P.phenolica、P.piscicida、P.rubra、P.spongiae、P.tunicata、P.ulvae。综合应用Solexa基因组测序技术和多轮手工PCR补缺,完成了 9株菌(不产色素菌株 P.agarivorans、P.arctica、P.espejiana、P.issachenkonii、P.nigrifaciens、P.tetraodonis、P.translucida 和产色素菌株 P.spongiae、P.tunicata)的基因组完成图及17株菌的高质量基因组草图的拼接。基因组比较分析发现,该属菌株的基因组大小具有很高的多样性,范围在4.03 Mb(P.undina)至6.14 Mb(P.rbra),其中,产色素菌株的基因组明显大于不产色素菌株,产色素菌株的基因组大小范围为4.75 Mb(P.ulvae)至6.14 Mb(P.rubra),不产色素菌株的大小范围为4.03 Mb(P.undina)至5.21 Mb(P.prydzensis)。此外,该属菌株的基因组GC含量为39.0%至47.8%。综合基因组完成图和共线性分析发现,该属26株模式菌株均包含一条大染色体和一条小染色体,其中大染色体的大小范围是3.15 Mb至4.83 Mb,小染色体的大小范围是0.68 Mb至1.60 Mb,小染色体大小占全基因组大小的比例是15.9%(P.ifaciens)至33.6%(P.sponiae)。此外,该属小染色体拥有质粒类型的复制体系(RepA复制起始蛋白)及维持体系(ParA-ParB染色体分离体系),同时拥有必需基因(包括参与组氨酸代谢的his基因簇)及与大染色体相似的核酸组成(GC含量和编码密度),这表明该属小染色体是质粒来源的染色体。(二)发现了该属两大类群在生态适应策略上的显著差异比较基因组分析发现,产色素菌株的基因组大小、GC含量、蛋白编码基因数、tRNA基因数普遍高于不产色素菌株,而且产色素菌株的基因组拥有更丰富多样的、更多的次级代谢基因簇(产色素菌含5～19个,不产色素菌含1～4个),这些均表明该属两大类群在基因组组成上具有显著差异。基于COG数据库的基因功能分类分析发现,产色素与不产色素类群的基因组偏好富集不同功能分类的基因:产色素菌株拥有更多的与防卫、信号转导、次级代谢等功能相关的基因;而不产色素菌株虽具有相对较小的基因组,但拥有更多的参与细胞壁/细胞膜/被膜生成、能量代谢、碳源利用等方面的基因。基于KEGG数据库,构建了产色素菌株和不产色素菌株共有的和特有的代谢通路,发现了两大类群的碳氮代谢存在明显差异。产色素菌株拥有完整的糖酵解途径,很多不产色素菌株因为缺失关键基因pfkA而糖酵解途径不通,而这些菌株含有更多拷贝的eda基因,表明他们的Entner-Doudoroff途径获得了增强,研究还发现不产色素菌株同时加强了柠檬酸循环;在氮源利用上,仅部分不产色素菌株可通过异化硝酸盐还原途径将环境中的硝酸盐/亚硝酸盐转换为氨而直接参与氨基酸的合成;同时,不产色素菌株通过加强乙酰CoA与乙酰乙酰CoA的相互转化而加强了葡萄糖、酮体、脂肪酸和氨基酸代谢之间的沟通,这使得不产色素菌株在碳源物质转化、储备及能量代谢上更有优势。此外,代谢通路分析和生理生化实验表明,不产色素菌株普遍具有多种糖类物质(如纤维素、蔗糖、麦芽糖等)的完整分解代谢通路及降解能力,而产色素菌株可以利用的糖类物质的种类则显著低于不产色素菌株。值得注意的是,产色素菌株整体上具有更强的几丁质分解代谢能力,使得产色素菌株可利用海洋中的几丁质(如甲壳类动物的外壳),为自身提供碳源和能量。上述功能基因组成和代谢通路的差异,均表明该属产色素和不产色素两大类群在生理和生态功能上存在很大差异:产色素类群通过强化与其他类群的相互作用,很可能在与海洋动物或藻类的共生或附生环境中(营养丰富而空间受限)更具有竞争优势;而不产色素菌株则通过增强营养获取、产能和细胞结构合成等,在营养竞争中获得优势,能够更好的适应海水等寡营养环境。(三)揭示了该属小染色体复制方向的多样性染色体复制体系的分析表明,该属的大染色体与Vibrio cholerae(多染色体细菌研究的模式菌)的大染色体的复制体系十分相似,两者在复制起始位点oriI序列、oriI附近的基因排列、复制体酶系的基因组成(复制起始基因dnaA、DNA聚合酶Ⅲ的β亚基dnaN、DNA促旋酶基因gyrB和DNA修复蛋白基因recF)等方面都具有很高的相似性。此外,该属的大染色体还有一些特有的复制相关体系,包括染色体二体解决体系(FtsK-XerCD复合体)、染色体结构维持体系(SMC-ScpAB复合体)和染色体分离体系(ParA1-ParB1)。该属小染色体的复制体系与V.cholerae小染色体完全不同,但与R1质粒的复制体系十分相似,两者均由RepA蛋白起始复制,由Tus蛋白终止复制,由ParA2-ParB2蛋白分离复制后的染色体。此外,该属小染色体上还编码了一些独特的复制相关的蛋白,包括参与细胞分裂的MinCDE复合体、DNA重组蛋白RmuC和DNA解旋酶YwqA等。已有基因组完成图的其他菌属的66株多染色体细菌(归属于细菌界5个门中的24个属)的GC skew分析发现,这些菌株的大染色体和小染色体均为双向复制。而假交替单胞菌属菌株的GC skew分析和染色体测序深度的梯度变化实验发现,该属绝大多数菌株的小染色体为单向复制,这表明假交替单胞菌属小染色体的单向复制方式在细菌界内是独特的。此外,在已研究的假交替单胞菌中,仅种P.spongiae的小染色体为双向复制,这表明该属小染色体的复制方向存在多样性,这在细菌界内是首次发现的。染色体同源性分析表明,种P.spongiae的小染色体与该属其他种小染色体拥有共同起源。由于该属小染色体起源于一个类似R1质粒的祖先且R1质粒为单向复制,因此,P.spongiae的小染色体很可能经历了从单向复制到双向复制的转化。染色体结构分析表明,在此复制方向的转化中,外缘DNA片段的插入很可能起重要作用。(四)初步研究了菌株Neptunomonas antrctica S3-22T适应南极海洋沉积物环境的遗传机制海洋特有细菌属Neptunomonas因其在海洋石油污染处理等领域的应用潜力而得到了广泛关注。本论文对分离自南极海域沉积物的该属新种菌株Neptunomonas antarctica S3-22T进行了全基因组测序、注释和分析,揭示了该菌适应南极沉积物环境的遗传机制。发现了一系列适应极地低温环境的机制,包括产生冷激蛋白与热激蛋白、双加氧酶等,也发现了一系列适应沉积物环境的机制,包括对重金属和有毒药物化合物等具有抗性、产生鞭毛辅助运动等。还发现该菌株可通过异化硝酸盐还原途径将外界环境中的硝酸盐/亚硝酸盐作为氮源,以供生长利用;而且可分解利用多种毒性芳香族物质,并可能将这些芳香族物质作为碳源加以利用。综上所述,本论文对海洋特有细菌属假交替单胞菌属26个种进行全基因组测序和比较基因组学研究,构建了该属的代谢通路,阐明了该属两大类群生理特性和生态分化的遗传学基础,该研究结果不仅为该属和相近类群的研究提供了丰富的基因组数据,而且推动了海洋细菌特别是富营养细菌的生态分化的研究;本论文系统研究了该属染色体的结构特点,首次发现了细菌染色体复制方向的多样性,丰富了对细菌染色体复制方式的认识,并为进一步开展研究提供了重要素材。