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寻求高效、安全、经济的农产品农药残留生物降解处理新技术，解决病虫害防治用药与农药残留的矛盾，是科研工作者需要迫切解决的具有重大经济和社会意义的科研命题。本文在以往研究基础上，对毒死蜱高效降解菌Hu-01(Cladosporium sp.)进行了活化复壮以恢复其降解性能，通过形态学和分子生物学技术确定了菌株的分类学地位；提取降解菌粗酶，并研究了粗酶特性；通过分离纯化，得到电泳纯的毒死蜱降解酶；克隆了降解酶基因并在大肠杆菌中实现了高效融合表达。主要结果如下：
通过对毒死蜱高效降解菌Hu-01形态学观察以及ITS区序列分子鉴定，鉴定该菌为半知菌亚门 Deuteromycotina、丝孢菌纲Hyphomycetes、丝孢菌目Moniliales、暗色菌科Demotiadium、枝孢属Cladosporium的Cladosporium cladosporioides(Fresen.)de Vries。
毒死蜱高效降解菌C.cladosporioides产生的降解酶可同时存在于胞内和胞外，但占细胞总降解酶71.69％的酶活位于胞内。经毒死蜱诱导实验，判定该酶为诱导酶。降解菌粗酶液在pH6.5、40℃相对活力最高。粗酶液热稳定性较好，但需在低温下(-20℃)贮存。源于真菌C.cladosporioides的毒死蜱高效降解酶既具有一定的专一性，又具有较广泛的底物适应性。胞内粗酶液对毒死蜱的米氏常数Km和最大反应速率Vmax分别为7.21 03 μmol·mL-1和1.9857 μmol·min-1。
毒死蜱高效降解菌C.cladosporioides分泌的胞内粗酶经硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-100凝胶过滤、DEAE FF离子交换柱层析、Sephacryl S-100凝胶过滤纯化，得到电泳纯的CPH。纯化蛋白CPH经质谱测序，N端氨基酸序列为：MEPDGELSALTQGANS；2个内肽段的N端氨基酸序列分别为：WAVPRISHCVS RSFAGIMTHQTV。同源性分析表明，毒死蜱降解酶CPH与鞘氨醇单胞菌TrkA-N-Novosphingobium aromaticivorans(strain DSM 12444)分泌的降解酶(Q2G571_NOVAD)同源性最高，一致性为30％。
毒死蜱降解酶CPH的特性研究表明，降解酶的适宜pH范围在6～7之间，表观最适pH为6.5；适宜温度范围在35℃～45℃之间，表观最适温度为40℃。另外，毒死蜱降解酶CPH在pH 5.5～7.5之间、30℃～50℃温度范围内较为稳定。巯基乙醇、二硫苏糖醇、Hg2+、Fe3+以及SDS对粗酶有强烈的抑制作用，而金属螯合剂EDTA则对酶活力无明显影响。最适条件下，毒死蜱降解酶CPH对毒死蜱的米氏常数Km=6.7674μmol·mL-1，最大反应速率Vmax=2.6473 μmol·min-1，催化常数Kcat=1 794.7797 min-1。根据质谱测序得到的降解酶N端和2个内肽段氨基酸序列以及Genbank公布的有机磷降解酶基因序列保守区域设计简并引物，以降解菌C.cladosporioides总DNA为模板，克隆得到毒死蜱高效降解酶基因cph部分片段。参照毒死蜱高效降解酶基因cph部分片段ORF设计简并引物，以降解菌总RNA为模板，利用RT-PCR和RACE技术，克隆得到降解酶基因cph 3和5端片段。分析全部测序结果，拼接出完整的毒死蜱降解酶基因cph，基因全长1489 bp，(G+C)％为55.7％，具有完整的开放阅读框，编码358个氨基酸，酶蛋白理论分子量为38.6 kDa，等电点为5.76。
氨基酸序列同源性分析表明，克隆获得的毒死蜱降解酶基因cph与来自微生物的多种基因都具有很高的同源性，一致性分别为23％～86％。毒死蜱降解酶基因cph推导的氨基酸与其它水解酶氨基酸的一致性为6.7％～32.4％，与假产碱假单胞菌Pseudomonas pseudoalcaligenes分泌的有机磷水解酶先驱同源性最高，与推导的来自红球菌Rhodococcus sp.RHA1有机磷酸酯酶同源性最低。
毒死蜱降解酶基因cph编码的蛋白组成中，酸性和碱性氨基酸各占10.67％和13.20％，极性和疏水性氨基酸各占23.80％和38.68％。整个蛋白分子呈现亲脂性，但在成熟蛋白序列中大约第200～220位和260～280位的氨基酸表现亲水性。预测的蛋白二级结构主要由α-螺旋和β-折叠构成。采用同源模建的方法预测了蛋白三级结构，推导的毒死蜱降解酶主要由α-螺旋、β-折叠、β-转角构成，高度折叠，整个蛋白分子呈紧密的球状。在同源建模的基础上，对毒死蜱降解酶基因cph编码的蛋白和毒死蜱进行了分子对接，从理论上验证了微生物降解毒死蜱的一般途径。
构建了毒死蜱降解酶基因cph原核表达载体pET28a-cph，在大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)中表达N端融合蛋白，表达分子量约37 kDa，主要以包涵体形式存在，经过亲和层析将N端融合的表达蛋白纯化。纯化的cph原核表达蛋白对毒死蜱的水解活性达到73.65 U/mg，明显高于野生酶，相当于出发菌株的4.4倍。原核表达蛋白主要以胞内不可溶性的包涵体存在，经过体外复性，比活增加到64.57 U/mg，是复性前的9倍多。重组菌株在LB平板上传代12代时，性能丢失；而在抗性LB平板上传代时，没有发现性能丢失现象。
在系统研究基础上，探讨了菌株复壮技术、ITS序列分析应用于菌株鉴定、有机磷农药降解酶酶促作用特点、降解酶的纯化技术、蛋白组学在降解酶研究中的应用以及有机磷降解酶基因和降解酶的高效表达等，深入阐述了菌株C.cladosporioides的应用前景、同源建模和分子对接、包涵体蛋白的复性、农药降解基因工程菌的构建以及有机磷水解酶传感器等，旨在丰富有机磷农药的微生物降解资源，为降解酶应用于实践提供理论依据。