论文部分内容阅读
目的:泛素特异性蛋白酶USP16在基因表达、细胞周期、细胞自我更新和/或衰老过程中起重要作用,且其在唐氏综合症中的过度表达是神经功能缺损的主要促进者,与神经干细胞缺陷密切相关。但USP16基因的转录调控基本上是未知的。本研究主要探讨核转录因子NFκB对人USP16基因的转录调控及其分子机制。方法:引物设计、质粒构建、细胞培养与转染、荧光素酶活性检测及分析、核蛋白和Ch IP DNA提取、电泳迁移率分析、染色质免疫共沉淀、细胞干预、实时定量PCR。结果:1.成功扩增USP16基因启动子区-1856至+468共2324bp DNA序列,插入载体p GL4.10构建重组荧光素酶报告基因质粒p USP16-A,在此基础上构建一系列删切质粒。并通过荧光素酶活性检测得到了一系列正性和负性调控区域。2.转录因子预测分析发现人USP16基因启动子区-1856至+468含有若干核转录因子结合位点,如:NFκB、HIF、SP1。3.根据转录因子预测结果显示的结合位点,依次构建4个重组荧光素酶报告基因质粒p USP16-N1~p USP16-N4。在HEK293细胞中,与空载PMTF相比,共转PMTF-p65质粒后荧光素酶活性分别增加2.69,2.51,2.24和2.04倍(p<0.001),并且对N1 vs.N3,N1 vs.N4以及N2vs.N4统计发现,结合位点2和3的缺失对NFkB在上调USP16基因启动子中的作用有很大的影响。在SH-SY5Y细胞中,得到类似的结果(p<0.001)。4.电泳迁移率分析,我们发现预测到的结合位点2,3和4在体外可与NFκB p65结合;而染色质免疫共沉淀实验表明,预测到的结合位点2和3可与NFkBp65结合,而位点1和4不能结合。6.LPS干预导致SH-SY5Y细胞内源性USP16 m RNA水平显着增加(1.58倍)(p<0.05),但在HEK293细胞中无显着影响(数据未显示)。然而,在HEK293细胞和SH-SY5Y细胞中,TNFa干预分别使内源性USP16 m RNA的水平增加了1.90倍(p<0.01)和1.85倍(p<0.05)。结论:人USP16基因的5’侧翼区,从-1856至+468,具有显著启动子活性;过表达NF?B p65可以上调人USP16启动子活性;无论在体内或体外,有两个(-826~-815和-510~-501)NF?B p65结合位点与均可与USP16相互作用;过表达NF?Bp65或LPS和TNFα的刺激活化NF?B均能上调人类USP16基因的转录。总之,NF?B可通过两个真正的顺式作用元件上调人USP16基因的转录。目的:分析棉鼠肺表面活性相关蛋白A(SP-A)基因序列结构和生物信息学特点,观察棉鼠肺损伤模型中SP-A m RNA和蛋白表达水平,初探SP-A表达规律与肺损伤的相关性。方法:将32只棉鼠随机均分为4组:3个实验组棉鼠分别腹腔注射2 mg/kg LPS处理24、48和96 h,对照组腹腔注射等量生理盐水。建模后提取肺组织总RNA,经RT-PCR扩增SP-A基因,并对其进行生物信息学分析;组织切片观察LPS作用不同时期肺组织病理学变化;q RT-PCR分析SP-A m RNA水平;蛋白印迹法检测SP-A蛋白表达。结果:棉鼠SP-A基因编码区长744bp,编码248个氨基酸,具有多个半胱氨酸保守位点、α螺旋结构和糖基化位点,与其他物种相比其核苷酸(75.4%~90.1%)和氨基酸(70.6%~87.1%)序列均具有较高同源性;在LPS诱导肺损伤模型中发现,与对照组相比,实验组肺组织病理学改变随LPS刺激时间延长而加重,具有时间依赖性;SP-A m RNA和蛋白表达水平在LPS处理24h后开始迅速增加,差异有统计学意义(P<0.001和P<0.01),48h时仍持续上升(P<0.001和P<0.01),96h时略有下降,但仍保持在较高水平,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05和P<0.01)。结论:棉鼠SP-A基因具有高度保守性;棉鼠SP-A m RNA和蛋白表达水平与肺损伤严重程度密切相关,可反应肺损伤的不同时程。