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目的:
高迁移率族蛋白B1(highmobilitygroupproteinB1,HMGB1)参与脓毒症和心血管疾病发生发展,但在脓毒症状态下其对心肌成纤维细胞(cardiacfibroblasts,CFs)的作用尚未见报道。鉴于心肌纤维化是心功能衰竭的重要病理特征,本研究探讨了小鼠CFs细胞在LPS刺激下分泌HMGB1的能力及其可能的分子机制;分析了CFs细胞分泌的HMGB1在Ⅰ、Ⅲ型胶原和骨桥蛋白表达中的作用;并以脓毒症小鼠模型为研究对象,整体观察了HMGB1对心肌纤维化及心功能的影响。
方法:
(1)HMGB1及其相关受体的检测:体外分离和培养小鼠CFs细胞,PCR检测HMGB1相关受体TLR2/4/9和RAGE等的表达。用LPS(500ng/ml)刺激CFs细胞后,台盼蓝染色检测细胞的活性;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Westernblot及免疫荧光染色检测HMGB1的表达及其在细胞内定位情况;同时利用qRT-PCR和Westernblot检测Ⅰ、Ⅲ型胶原和骨桥蛋白mRNA、蛋白的表达水平。
(2)HMGB1表达与PKCβ-Erk1/2信号通路关系的分析:体外采用LPS刺激细胞后,通过Westernblot方法检测PKCβ-Erk1/2信号分子的活化情况;PKCβ抑制剂阻断后Westernblot检测HMGB1的表达情况。
(3)HMGB1对CFs细胞的刺激作用:体外应用rHMGB1刺激CFs细胞,Westernblot法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和骨桥蛋白,同时用PKCβ抑制剂或EP进行HMGB1的阻断试验。
(4)小鼠脓毒症模型的诱导及HMGB1与心肌纤维化关系的体内研究:腹腔注射LPS(10mg/kg)诱导小鼠脓毒症模型,B超检测LPS注射24小时后小鼠心脏收缩功能的变化。免疫荧光法检测脓毒症小鼠心肌组织HMGB1的水平,并用天狼星红染色评估其胶原沉积情况。
结果:
(1)成功分离小鼠CFs细胞,其表面表达TLR2及TLR4,未检测到TLR9和RAGE的明显表达。LPS(500ng/ml)刺激CFs细胞48h后细胞活性无明显变化,qRT-PCR及Westernblot显示HMGB1的表达明显增高,与未处理组相比有统计学差异(P<0.05)。免疫荧光染色观察到HMGB1由细胞核向细胞浆的易位,并在细胞上清中检测到HMGB1。
(2)经Westernblot检测发现,LPS刺激CFs细胞后信号分子PKCβ-Erk1/2的磷酸化水平明显增高,而PKCβ抑制剂处理后,CFs细胞分泌HMGB1的水平降低。
(3)通过qRT-PCR和Westernblot检测发现,LPS刺激CFs细胞后Ⅰ、Ⅲ型胶原和骨桥蛋白的mRNA与蛋白表达均明显增加;PKCβ抑制剂和EP抑制内源性HMGB1释放后,胶原和骨桥蛋白的表达下调。同时,Westernblot检测发现,外源性rHMGB1刺激CFs细胞后Ⅰ型胶原和骨桥蛋白表达明显增加。
(4)体内研究发现,脓毒症小鼠心肌组织HMGB1表达水平明显增高,脓毒症后期心肌组织出现大量胶原沉积。B超检测结果显示,脓毒症小鼠心脏收缩功能明显下降,EP治疗后收缩功能明显改善。
结论:
(1)本研究发现CFs细胞在LPS刺激后能主动分泌HMGB1,其分泌可能是通过激活PKCβ-Erk1/2信号通路。
(2)体内、外实验研究表明,HMGB1能增强心肌纤维化相关指标Ⅰ、Ⅲ胶原和骨桥蛋白的表达。脓毒症小鼠HMGB1表达的增加,影响心脏收缩功能和增加心肌纤维化水平。