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目的复方绿柳颗粒(LvLiuKeLi,LLKL)由绿萝花(Edgewortahi gardneri(Wall.)Meisn.)、柳茶(Sibiraea angustata)、藏红花(CrocussativusL.(saffron))组成,本研究观察LLKL改善2型糖尿病ZDF(Zucker Diabetic Fatty)大鼠胰岛素抵抗的作用效果,并与其组方单味药的作用效果比较,探究LLKL改善ZDF大鼠胰岛素抵抗的作用机制,为LLKL的临床应用提供科学实验依据。方法本研究采用随机对照实验设计,以雄性ZDF(fa/fa)大鼠,pumina#5008饲料诱导喂养4周,非同日两次测得尾尖空腹血糖(Fasting bloodglucose,FBG)大于7.8mmol/L为糖尿病模型大鼠。筛选符合条件的大鼠64只,根据体重(Body Weight,BW)和FBG采用分层随机法分为8组,每组8只,分别为模型组(Model,MOD)、绿柳颗粒高剂量组(LLKL_H)、绿柳颗粒中剂量组(LLKL_M)、绿柳颗粒低剂量组(LLKL_L)、绿萝花组(Edgeworthia gardneri(Wall.)Meisn.)、柳茶组(Sibiraea angustata)、藏红花组(Crocus sativus L.(saffron))及二甲双胍组(Metformin,MET)。以8只同周龄的瘦型雄性 Zucker(Zucker Lean Normoglycemic,+/fa)大鼠为正常对照组(Normal control,NC)。按照人与大鼠体表面积折算法确定各组给药剂量,分别为:LLKL_H:4.68g/kg/d、LLKL_M:2.34 g/kg/d、LLKL_L:1.17 g/kg/d、Edgeworthia gardneri(Wall.)Meisn.:1.35 g/kg/d、Sibiraea angustata:0.9 g/kg/d、Crocus sativus L.(saffron):0.09 g/kg/d。以0.135 g/kg/d的MET作为评价药效的阳性对照。NC组和MOD组均给予同等剂量体积的去离子水(1 mL/100g),连续灌胃给药6周。实验过程中观察记录各组大鼠毛色、精神状态等情况,记录BW、FBG,并于给药6周后进行口服葡萄糖耐量实验(Oralglucose tolerance test,OGTT)、胰岛素耐量实验(Insulin tolerance test,ITT)并记录进食量(Food intake)。给药6周实验结束后大鼠过夜禁食12 h,戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉下进行腹主动脉取血,3000 g,15 min,4℃条件下离心分离血清、分装后冻存备用;分离完整肝脏并称量肝重(Liverweight),计算肝湿重指数(Liverweight/BW);快速收集并冻存粪便及肝脏、小肠组织,4%多聚甲醛固定或冻存备用。检测血清中胰岛素水平(Fasting insulin,FINS),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),检测血清游离脂肪酸(Free fatty acids,FFA)、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)及炎症相关因子白介素-6(Interleukin-6,IL-6),肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)表达水平;对肝脏组织进行苏木素-伊红染色(Haematoxylinandeosin,HE染色)、油红O染色、肝糖原染色(PAS)以及甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Totalcholesterol,TC)含量检测,观察肝脏组织形态及糖脂代谢变化;对小肠组织进行HE染色及肠道紧密连接蛋白Occludin免疫组化染色,观察肠道组织形态变化;利用Illumina高通量测序对肝脏进行全转录组学测序及生物信息学分析,探究LLKL对ZDF大鼠肝脏的作用机制。对粪便进行16S rDNA肠道菌群测序并分析,探究LLKL对ZDF大鼠肠道菌群的影响。结果1 对ZDF糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响①LLKL对胰岛素抵抗的影响:给药6周后,与NC组相比,MOD组大鼠BW,Food intake、FBG、OGTT-AUC、ITT-AUC、FINS、HOMA-IR 均显著升高(P<0.001)。与MOD组相比,LLKL_H、LLKL_M、LLKL_L及MET组均能不同程度的降低FBG、OGTT-AUC、ITT-AUC、FINS、HOMA-IR(P<0.01 或 P<0.001),且 LLKL_H 组降低最显著;给药6周后,各给药组BW及Food intake与MOD组相比无显著差异(P>0.05)说明LLK可以降低ZDF糖尿病大鼠血糖,改善胰岛素抵抗,LLKL_H组效果最佳,且优于 0.135 g/kg/d 的 MET。②LLKL与单味药物对胰岛素抵抗作用的比较:给药6周后,与MOD组相比,Edgeworthia gardneri(Wall.)Meisn.、Sibiraea angustata 及Crocus sativus L.(saffron)组均能不同程度的降低 FBG、OGTT-AUC、ITT-AUC、FINS、HOMA-IR(P<0.05,P<0.01或P<0.001),但三组降低程度均没LLKL_M组显著;Edgeworthia gardneri(Wall.)Meisn.、Sibiraeaangustata及CrocussativusL.(saffron)组BW和Food intake均无显著变化(P>0.05)。说明单味药Edgeworthia gardneri(Wall.)Meisn.、Sibiraea angustata及Crocus sativusL.(saffron)也有降低ZDF糖尿病大鼠血糖,改善胰岛素抵抗的作用,但LLKL_M组比单味药组效果好。2 对ZDF糖尿病大鼠肝脏糖脂代谢及转录组的影响给药6周后,与NC组相比,MOD组大鼠肝脏肝细胞出现脂肪变性及脂肪空泡,肝细胞排列紊乱,PAS染色可见肝糖原含量显著降低,油红O染色可见大量广泛分布的橘红色脂肪颗粒,肝湿重指数、肝TC、TG含量、血清FFA水平均显著增高(P<0.001);与MOD组相比,LLKL_H、LLKL_M及LLKL_L组肝脏有显著改善,可见肝细胞排列趋于整齐,无明显脂肪空泡,肝糖原分布显著增多,且脂肪样变减轻,橘红色脂肪颗粒显著减少,肝湿重指数、肝TC、TG含量、血清FFA水平均显著降低(P<0.05,P<0.01或P<0.001),说明复方LLKL具有改善ZDF大鼠肝脏糖脂代谢的作用。肝脏转录组学测序分析结果显示:与NC组相比,MOD组显著差异表达的mRNA有1459条;与MOD组相比,LLKL_H组显著差异表达的mRNA有740条。差异mRNA功能和通路富集结果显示,MOD vs.NC组显著差异表达基因显著与氧化还原(GO:0055114～Oxidation-reduction process)、蛋白质磷酸化(GO:0006468～Protein phosphorylation)等生物学过程相关,参与代谢通路(rno01100:Metabolic pathways)、氧化磷酸化(rno00190:Oxidative phosphorylation)等 KEGG 信号通路;同时,LLKL_H vs.MOD组显著差异表达基因参与蛋白质翻译(GO:0006412～Translation)、细胞对DNA损伤的应答(GO:0006974～Cellularresponseto DNA damage stimulus)等生物学过程相关,参与代谢通路(rno01 100:Metabolic pathways)、Toll 样受体信号通路(rno04620:Toll-like receptor signaling pathway)等 KEGG 信号通路;RT-qPCR 验证了 Toll 样受体 4(Toll like receptor 4,TLR4)及富集在Toll样受体信号通路上的显著差异基因组蛋白酶K(Cathepsin K,CTSK)和髓样分化因子 88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)在MOD组高表达,而在LLKL_H组表达量降低,说明Toll-like receptor signaling pathway可能是LLKL改善ZDF糖尿病大鼠胰岛素抵抗的信号通路之一。3绿柳颗粒对ZDF糖尿病大鼠小肠及肠道菌群的影响给药6周后,NC组大鼠小肠结构完整,小肠绒毛排列整齐,与NC组相比,MOD组小肠表现为肠绒毛排列紊乱、塌陷、隐窝变深;与MOD组相比,LLKL_H、LLKL_M及LLKL_L给药组小肠形态有明显改善。与NC组相比,MOD组大鼠小肠紧密连接蛋白Occludin表达量降低(P<0.05),血清LPS、TNF-α及IL-6表达量升高(P<0.05);与MOD组相比,LLKL_H、LLKL_M及LLKL_L组大鼠小肠紧密连接蛋白Occludin表达量升高(P<0.001),血清LPS、TNF-α及IL-6表达量降低(P<0.01或P<0.001)。说明LLKL治疗能降低ZDF糖尿病大鼠小肠通透性,增加肠道屏障功能,降低血清炎症因子水平。16S rDNA肠道菌群测序结果显示:与NC组相比,MOD组肠道菌群α多样性和β多样性显著降低;与MOD组相比,LLKL_H及LLKL_M组肠道菌群α多样性和β多样性显著升高。在门水平,丰度最高的5种微生物分别是Firmicutes,Actinobacteria,Proteobacteria,Bacteroidetes和Verrucomicrobia;与 NC 组相比,MOD 组Bacteroidetes丰度降低,Firmicutes丰度升高,Bacteroidetes/Firmicutes显著降低;与MOD组相比,LLKL_H 及 LLKL_M 给药组 Bacteroidetes丰度升高,Firmicutes丰度降低,Bacteroidetes/Firmicutes 显著升高。GSEA分析发现:MyD88高表达与甘油脂质代谢(Glycerolipid metabolism)(NES=1.347158,P=0.05814,FDR q=1)正相关,与胰岛素信号通路(Insulin signaling pathway)(NES=-1.0536,P=0.388614,FDRq=1)负相关;CTSK 高表达与脂肪酸代谢(Fatty acid metabolism)(NES=1.626464,P=0.008032,FDR q=0.469346)及甘油脂质代谢(Glycerolipidmetabolism)(NES=1.515651,P=0.071567,FDRq=0.602147)正相关,与胰岛素信号通路(Insulinsignalingpathway)(ES=-1.3491,P=0.044922,FDRq=1)负相关。因此LLKL可能通过抑制MyD88、CTSK的表达,显著上调Insulin signaling pathway,下调 Glycerolipid metabolism 和 Fatty acid metabolism 信号通路。结论1 LLKL可改善ZDF糖尿病大鼠胰岛素抵抗,效果优于单味药,且高剂量组效果最显著,优于 0.135 g/kg/d 的 MET。2LLKL可改善ZDF糖尿病大鼠肝脏糖脂代谢,机制可能与其调节蛋白质翻译、细胞对DNA损伤的应答,代谢通路、Toll样受体信号通路等有关;RT-qPCR验证了 TLR4及富集在Toll样受体信号通路上的差异基因CTSK和MyD88在MOD组高表达,在LLKL_H组表达降低,说明Toll样受体信号通路可能是LLKL改善ZDF大鼠胰岛素抵抗的信号通路之一。3 LLKL可调节ZDF糖尿病大鼠肠道微生物,增加肠道菌群多样性,升高Bacteroidetes,降低Firmicutes,使Vacteroidetes/Firmicutes比例显著升高;改善ZDF糖尿病大鼠肠道结构,增加肠道屏障功能,减少LPS及炎症反应,影响“肠-肝轴”调节Toll样受体信号通路,降低TLR4、CTSK和MyD88表达,从而抑制脂肪酸代谢及甘油脂代谢、促进胰岛素信号通路,改善胰岛素抵抗,治疗糖尿病。