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目的
研究miR-3910在肝癌中的表达模式，探索miR-3910在肝癌发生发展中的功能及分子机制。
方法
第一部分：收集40例肝癌组织以及配对的癌旁组织，定量PCR(qPCR)检测miR-3910在肝癌组织及其癌旁组织中的表达；在正常肝细胞(L02)以及肝癌细胞(Huh-7和7404)中转染外源的组成性活化的KrasV12，检测KrasV12的表达对miR-3910表达水平的影响。
第二部分：利用MTT实验检测miR-3910的表达对肝癌细胞生长的影响，利用Boydenchamber实验检测miR-3910的表达对肝癌细胞迁移能力的影响，利用软琼脂克隆集落实验检测miR-3910的表达对肝癌细胞非锚定性生长的影响，miR-3910对肝癌细胞7404转移能力的影响通过肝内转移实验进行检测。
第三部分：使用miRNA的三大数据库预测miR-3910潜在的靶基因MST1，并通过比较miR-3910和MST1在肝癌标本中的表达水平，以及检测miR-3910的表达对MST1在肝癌细胞凋亡和克隆集落中的功能的影响进行验证。
结果
第一部分：miR-3910在肝癌中的表达模式
1.肝癌组织中miR-3910的表达水平比癌旁组织中高。以U6为内参，癌旁组织中U6与miR-3910的Ct(Cycle Threshold)值之差Ct(U6-miR-3910)为-18.7±0.4，癌组织中U6与miR-3910的Ct值之差Ct(U6-miR-3910)为-17.3±0.3。两组之间的均值差异达到显著水平(P<0.01)。
2.miR-3910在正常肝细胞(Chang和L02)中的表达水平最低，其在一系列肝癌细胞株中的表达水平普遍升高，特别是Hep3B、HepG2、QGY和MHCC97。
3.在7404和Huh-7细胞中过表达Flag-KrasV12后，miR-3910表达上调。与对照细胞相比，过表达Flag-KrasV12的7404细胞其miR-3910的表达上调约2倍；过表达Flag-KrasV12的Huh-7细胞其miR-3910的表达上调约6倍。
第二部分：miR-3910在肝细胞癌进展中的功能。
1.在肝癌细胞7404和Huh-7中过表达miR-3910促进肝癌细胞生长、迁移和克隆集落。miR-3910过表达稳定细胞株中，miR-3910的表达水平是对照细胞的6-12倍。在细胞生长实验中，miR-3910过表达组的吸光度是对照组吸光度值的1.5倍左右。统计学分析表明，两组之间的吸光度具有显著差异。在细胞迁移实验中，miR-3910过表达组发生迁移的细胞是对照组的1.5-2.0倍。在克隆集落实验中，与对照细胞相比，过表达miR-3910的7404细胞能在软琼脂上形成更多的克隆。
2.在肝癌细胞7404和Huh-7中miR-3910的功能丧失抑制肝癌细胞生长、迁移和克隆集落。miR-3910功能丧失导致7404和Huh-7细胞的生长受到抑制。实验组的吸光度约为对照组的60%～70%。与此一致的是，miR-3910功能丧失导致7404和Huh-7细胞的迁移能力下降约50%。在克隆集落形成实验中，miR-3910功能丧失显著抑制7404在软琼脂上形成克隆的数量，具有统计学意义(P<0.01)。
3.在7404中miR-3910功能丧失削弱肝癌细胞在裸鼠肝脏内的转移能力。对照组和实验组小鼠的肝脏大小无显著差异。与对照细胞相比，miR-3910功能丧失后，7404细胞几乎不能形成肉眼可见的肝内转移。在生存分析实验中，对照小鼠在第40天有半数小鼠死亡，miR-3910功能丧失组在第40天时没有小鼠死亡，显示了miR-3910功能丧失显著延长小鼠生存时间。
第三部分：在肝癌细胞中miR-3910抑制MST1的表达。
1.MST1的3’-UTR区域与miR-3910的序列相匹配。在7404和Huh-7中转染miR-3910下调MST1的蛋白水平，而转染anti-miR-3910上调MST1的蛋白水平。在肝癌样本中，miR-3910与MST1的mRNA的丰度呈现反向变化的趋势。
2.在7404和Huh-7细胞中，miR-3910以剂量依赖的方式激活YAP/TEAD报告基因的活性。在7404细胞中过表达miR-3910上调YAP以及下游靶基因Cyr61、CTGF和CyclinE的蛋白水平，但是过表达anti-miR-3910下调YAP以及下游靶基因Cyr61、CTGF和CyclinE的蛋白水平。
3.在AnnexinⅤ/PI染色细胞凋亡分析中，在7404细胞中过表达MST1促进细胞凋亡，此现象可被miR-3910过表达所回复。在软琼脂克隆集落分析中，也可观察到类似现象。
结论
1.miR-3910在肝癌组织中表达上调。KrasV12对其表达有诱导作用。
2.miR-3910促进肝癌细胞生长、迁移和克隆集落，miR-3910功能丧失抑制肝癌细胞生长、迁移、克隆集落和肝内转移。
3.在肝癌细胞中，miR-3910通过靶向MST1，激活YAP的转录活性。
研究miR-3910在肝癌中的表达模式，探索miR-3910在肝癌发生发展中的功能及分子机制。
方法
第一部分：收集40例肝癌组织以及配对的癌旁组织，定量PCR(qPCR)检测miR-3910在肝癌组织及其癌旁组织中的表达；在正常肝细胞(L02)以及肝癌细胞(Huh-7和7404)中转染外源的组成性活化的KrasV12，检测KrasV12的表达对miR-3910表达水平的影响。
第二部分：利用MTT实验检测miR-3910的表达对肝癌细胞生长的影响，利用Boydenchamber实验检测miR-3910的表达对肝癌细胞迁移能力的影响，利用软琼脂克隆集落实验检测miR-3910的表达对肝癌细胞非锚定性生长的影响，miR-3910对肝癌细胞7404转移能力的影响通过肝内转移实验进行检测。
第三部分：使用miRNA的三大数据库预测miR-3910潜在的靶基因MST1，并通过比较miR-3910和MST1在肝癌标本中的表达水平，以及检测miR-3910的表达对MST1在肝癌细胞凋亡和克隆集落中的功能的影响进行验证。
结果
第一部分：miR-3910在肝癌中的表达模式
1.肝癌组织中miR-3910的表达水平比癌旁组织中高。以U6为内参，癌旁组织中U6与miR-3910的Ct(Cycle Threshold)值之差Ct(U6-miR-3910)为-18.7±0.4，癌组织中U6与miR-3910的Ct值之差Ct(U6-miR-3910)为-17.3±0.3。两组之间的均值差异达到显著水平(P<0.01)。
2.miR-3910在正常肝细胞(Chang和L02)中的表达水平最低，其在一系列肝癌细胞株中的表达水平普遍升高，特别是Hep3B、HepG2、QGY和MHCC97。
3.在7404和Huh-7细胞中过表达Flag-KrasV12后，miR-3910表达上调。与对照细胞相比，过表达Flag-KrasV12的7404细胞其miR-3910的表达上调约2倍；过表达Flag-KrasV12的Huh-7细胞其miR-3910的表达上调约6倍。
第二部分：miR-3910在肝细胞癌进展中的功能。
1.在肝癌细胞7404和Huh-7中过表达miR-3910促进肝癌细胞生长、迁移和克隆集落。miR-3910过表达稳定细胞株中，miR-3910的表达水平是对照细胞的6-12倍。在细胞生长实验中，miR-3910过表达组的吸光度是对照组吸光度值的1.5倍左右。统计学分析表明，两组之间的吸光度具有显著差异。在细胞迁移实验中，miR-3910过表达组发生迁移的细胞是对照组的1.5-2.0倍。在克隆集落实验中，与对照细胞相比，过表达miR-3910的7404细胞能在软琼脂上形成更多的克隆。
2.在肝癌细胞7404和Huh-7中miR-3910的功能丧失抑制肝癌细胞生长、迁移和克隆集落。miR-3910功能丧失导致7404和Huh-7细胞的生长受到抑制。实验组的吸光度约为对照组的60%～70%。与此一致的是，miR-3910功能丧失导致7404和Huh-7细胞的迁移能力下降约50%。在克隆集落形成实验中，miR-3910功能丧失显著抑制7404在软琼脂上形成克隆的数量，具有统计学意义(P<0.01)。
3.在7404中miR-3910功能丧失削弱肝癌细胞在裸鼠肝脏内的转移能力。对照组和实验组小鼠的肝脏大小无显著差异。与对照细胞相比，miR-3910功能丧失后，7404细胞几乎不能形成肉眼可见的肝内转移。在生存分析实验中，对照小鼠在第40天有半数小鼠死亡，miR-3910功能丧失组在第40天时没有小鼠死亡，显示了miR-3910功能丧失显著延长小鼠生存时间。
第三部分：在肝癌细胞中miR-3910抑制MST1的表达。
1.MST1的3’-UTR区域与miR-3910的序列相匹配。在7404和Huh-7中转染miR-3910下调MST1的蛋白水平，而转染anti-miR-3910上调MST1的蛋白水平。在肝癌样本中，miR-3910与MST1的mRNA的丰度呈现反向变化的趋势。
2.在7404和Huh-7细胞中，miR-3910以剂量依赖的方式激活YAP/TEAD报告基因的活性。在7404细胞中过表达miR-3910上调YAP以及下游靶基因Cyr61、CTGF和CyclinE的蛋白水平，但是过表达anti-miR-3910下调YAP以及下游靶基因Cyr61、CTGF和CyclinE的蛋白水平。
3.在AnnexinⅤ/PI染色细胞凋亡分析中，在7404细胞中过表达MST1促进细胞凋亡，此现象可被miR-3910过表达所回复。在软琼脂克隆集落分析中，也可观察到类似现象。
结论
1.miR-3910在肝癌组织中表达上调。KrasV12对其表达有诱导作用。
2.miR-3910促进肝癌细胞生长、迁移和克隆集落，miR-3910功能丧失抑制肝癌细胞生长、迁移、克隆集落和肝内转移。
3.在肝癌细胞中，miR-3910通过靶向MST1，激活YAP的转录活性。