背景:替莫唑胺(temozolomide,TMZ)作为目前国内外治疗恶性胶质瘤的一线化疗药物,虽然在胶质瘤治疗中取得一定疗效,但对恶性胶质瘤的有效率仍不高,耐药和快速复发是关键原因。胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)在胶质瘤的发生发展、耐药和复发中起关键作用,被认为是胶质瘤化疗抵抗的根源,已成为治疗的重要新靶点。因此,如何提高TMZ的疗效、增强TMZ对GSCs的敏感性是亟待解决的问题。最近研究显示,TMZ可通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信号通路并抑制雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)使胶质瘤细胞发生凋亡;但使用临床浓度的TMZ可引起内源性蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)活化,是肿瘤细胞发生耐药及逃避TMZ杀伤的一种代偿保护性机制。二甲双胍(metformin,MET)作为一种最广泛用于治疗Ⅱ型糖尿病的药物,可激活AMPK,激活的AMPK继而进一步抑制m TOR活性,从而达到抗肿瘤作用;还可以抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信号通路,降低细胞内Akt磷酸化水平,从而选择性杀伤肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)。然而,TMZ与MET合用是否能进一步活化AMPK,并抑制Akt的活性,进而协同抑制或清除GSCs,目前国内外尚无此方面研究。目的:本研究的目的是观察TMZ联合MET对胶质瘤及其干细胞性能的影响,并探讨这些影响的分子机制。方法:1.无血清培养法培养分选GSCs,镜下观察神经肿瘤球生长形态,免疫荧光法鉴定GSCs,流式细胞术检测CD133+GSCs比例。2.TMZ,MET以及TMZ+MET分别作用于胶质瘤及其干细胞;CCK-8法测细胞增殖率/抑制率;Calcu Syn软件分析两药联合指数(Combination index,CI);镜下观察GSCs自我更新和二次成球能力;流式细胞术检测GSCs凋亡率,Western blot检测凋亡相关蛋白;Transwell小室观察GSCs侵袭能力。3.TMZ、MET以及PI3K/m TOR双重抑制剂NVP-BEZ235三者单独或联合作用于GSCs,Western blot检测GSCs中PI3K/Akt/m TOR信号通路的表达;流式细胞术检测NVP-BEZ235联合TMZ和/或MET对GSCs凋亡率的影响。4.TMZ、MET以及AMPK抑制剂Compound C三者单独或联合作用于U87-GSCs、U251-GSCs,Western blot检测GSCs中AMPK的表达;流式细胞术检测Compound C联合TMZ和/或MET对GSCs凋亡率的影响。采用SPSS 19.0统计软件进行Student’s t检验,P<0.05为具有统计学意义。结果:1.无血清培养法可培养出稳定表达CD133和Nestin的神经肿瘤球;神经肿瘤球具有自我更新和二次成球能力;在神经肿瘤球中,CD133+的U87-GSCs、U251-GSCs比例分别为86.2±6.3%,82.8%±7.1%;将神经肿瘤球置于分化培养基中培养7d后,神经肿瘤球显示出多向分化能力,表达GFAP、β-tubulin III等分化标志物,基本不表达CD133、Nestin等神经干细胞标志物。2.TMZ与MET单独应用时对胶质瘤及其干细胞增殖有抑制作用(P<0.05),呈时间-浓度依赖性;与单药组比较,TMZ与MET联合应用时对胶质瘤及其干细胞抑制率更高(P<0.05),且具有协同作用(CI<1);TMZ及MET单独应用时对GSCs的自我更新及二次成球能力有抑制作用(P<0.05);与单药组比较,TMZ与MET联合使用时GSCs的自我更新及二次成球能力明显下降(P<0.05);与对照组比较,TMZ、MET和TMZ+MET对U87-GSCs的凋亡率分别为31.0±5.9%(P<0.05)、26.8±6.6%(P<0.05)和52.3±9.7%(P<0.01),对U251-GSCs的凋亡率分别为33.1±6.7%(P<0.05)、20.1±4.9%(P<0.05)和48.7±9.2%(P<0.01);在U87-GSCs和U251-GSCs中,联合用药组的细胞凋亡率均明显高于单药组(P<0.05);与单药组比较,联合用药组凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达有了明显的减少,而细胞凋亡相关蛋白Bax和Cleaved Caspase-3的表达有所升高;与单药组比较,TMZ与MET联合使用时GSCs的侵袭能力明显下降(P<0.05)。以上结果表明TMZ联合MET对GSCs具有协同清除作用。3.TMZ可引起Akt磷酸化表达水平增高,呈时间依赖性,但其下游信号通路m TOR、4EBP1和S6K磷酸化表达水平降低;MET可引起Akt磷酸化表达水平降低,呈时间-浓度依赖性,其下游信号通路m TOR、4EBP1和S6K磷酸化表达水平随着Akt的降低而降低;TMZ联合MET作用于GSCs后,MET可反转由TMZ引起的Akt活性升高,且m TOR、4EBP1和S6K磷酸化表达水平明显降低;各组分别加入PI3K/m TOR双重抑制剂NVP-BEZ235后,不仅Akt、m TOR、4EBP1和S6K磷酸化表达水平均降低,相应的细胞凋亡率相比加入NVP-BEZ235前也更高(P<0.05)。以上结果表明,MET反转由TMZ引起的Akt活性升高,并共同抑制m TOR及其下游信号通路是TMZ和MET有协同杀伤GSCs的重要原因。4.TMZ可引起AMPK磷酸化表达水平增高,呈时间-浓度依赖性;MET可也引起AMPK磷酸化表达水平增高,呈时间-浓度依赖性;TMZ联合MET作用于GSCs后,AMPK磷酸化表达水平进一步增高;各组分别加入AMPK抑制剂Compound C后,不论单药组还是联合用药组AMPK磷酸化表达水平均降低;Compound C可降低由TMZ导致的细胞凋亡率(P<0.05),对MET以及TMZ+MET导致的细胞凋亡率无明显降低(P>0.05)。以上结果表明,TMZ通过激活AMPK导致GSCs凋亡,但MET引起的AMPK活性升高并不是MET导致GSCs凋亡的主要原因;TMZ联合MET虽可共同激活AMPK信号通路,但此途径并不是其具有协同杀伤清除GSCs的主要原因。结论:1.无血清培养法可培养、分选出性能稳定的GSCs,这些GSCs具有自我更新能力和多向分化能力。2.TMZ联合MET对胶质瘤及其干细胞具有协同杀伤和清除作用。3.MET能反转由TMZ引起的Akt活性升高并共同抑制m TOR及其下游信号通路是TMZ联合MET具有协同清除GSCs的主要机制。4.TMZ联合MET可共同激活GSCs AMPK信号通路,但此通路并不是TMZ联合MET具有协同清除GSCs作用的主要原因。