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第一部分基于液质联用技术的急性胰腺炎血浆代谢组学分析目的:通过液相色谱与质谱联用技术对不同严重程度的急性胰腺炎(Acute Pancreatitis,AP)患者血浆样本进行检测,并以健康志愿者血浆样本作为对照,筛选出不同严重程度AP患者血浆代谢谱变化的特征性离子并进行物质鉴定,通过代谢通路等分析差异代谢物相关的生物学意义,进而初步分析这些代谢物质在AP的诊断及严重程度评估中可能具有的潜在临床价值。方法:收集2017年7月至2017年12月苏州大学附属第一医院的87例AP住院患者血浆样本,其中轻型急性胰腺炎(Mild Acute Pancreatitis,MAP)48例,重症急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis,SAP)39例,另采集体检的30例健康志愿者血浆作为对照。采用液相色谱与质谱联用技术加以分析,检测不同严重程度的AP患者和健康对照者的血浆小分子代谢物。采用多元统计分析方法,构建主成分分析、偏最小二乘判别分析、正交-偏最小二乘判别分析等模型对样本和组间变异信息加以评估,并采用交叉验证、置换检验、以及训练集-测试集等方法对模型进行验证,初步评价分类模型的分类效果和预测能力。随后对差异代谢物进行筛选,采用PLS-DA第一主成分VIP值(variable importance)结合Mann-Whitney-Wilcoxon Test检验筛选差异代谢物,以p-value≤0.05且VIP≥1为有统计学意义。差异代谢物的鉴定首先根据精确分子量进行初步确认,推测其可能的分子式,然后依据MS/MS碎片信息比对公共数据库(Metlin,Human Metabolome Database(HMDB),massbank,Lipid Maps,Mzclound)确认差异代谢物。结果:本次实验正离子模式共获得1314个前体分子,负离子模式获得1110个前体分子,由总离子流基峰色谱图可见,三组间代谢物离子峰值差异显著。PCA、PLS-DA、OPLS-DA三种模型都具有很好的可解释度(R2X>0.5)。由PCA得分图可以观察到,健康志愿者、MAP、SAP三组血浆样本具有一定的区分聚类趋势,获得了较好的分类模型。PLS-DA模型使组间对比的差异进一步凸显,三组样本呈明显的区分聚类,无论正负离子模式下,均有大于95%的样本符合模型判别(R2Y>0.95),且具有较高的可预测性(Q2>0.85)。在OPLS-DA模型中,随机抽取62.5%的样本(22例SAP、30例MAP、20例对照)作为训练集,用于构建OPLS-DA模型,抽取38.5%(17例SAP、18例MAP、10例对照)作为测试集,用于测试模型的可靠性。结果此组OPLS-DA分析共有5个主成分(2个预测主成分,3个正交主成分),在OPLS-DA得分图上清晰可见三组区分聚类愈发显著,且模型具有较好的拟合度和可预测度(R2X=0.357,R2Y=0.948,Q2=0.839)。同时测试集的样本均在图中能正确的归入分组聚类,经过训练集-测试集模型验证了该模型具有很好的分类效果和预测能力。共筛选并鉴定出35个差异代谢物,其中有15个代谢物在AP患者血浆中的浓度水平高于对照组,且在SAP组的浓度水平显著增高,表明它们可能是提示AP严重程度的潜在差异代谢物。它们分别是:D-焦谷氨酸,羟基异己酸、乙酰肉碱、β-丙氨酸、L-肉碱、肌酸、吲哚乳酸,犬尿氨酸,棕榈酰肉碱,辛酰肉碱、L-苯丙氨酸、苹果酸、酮戊二酸、苏氨酸、尿酸。另有13个代谢物在AP组浓度水平较对照组增加,且在MAP组最高,而SAP组较MAP组下降,提示这些可能是AP早期诊断的潜在代谢标志物或MAP的特征性标志物。这13个代谢物分别是:2-氨基异丁酸,3-丁烯-1-胺,当归酸,D-β羟基丁酸、谷氨酸、谷氨酰胺、L-组氨酸、L-缬氨酸,L-亮氨酸、壬二酸、丁二醛、N,N-二甲基甘氨酸,1-磷酸鞘氨醇。在SAP中硫酸吲哚酚的水平显著高于MAP组和对照组,提示其可能是SAP的预测性标志物。结论:LC-MS代谢组学技术可以有效地识别不同严重程度AP患者血浆代谢物的变化,筛选出的差异代谢物对AP严重程度的分级可能具有潜在的临床应用价值。第二部分基于液质联用技术的急性胰腺炎尿液代谢组学分析目的:通过液相色谱与质谱联用技术对不同严重程度的AP患者尿液样本进行检测,并以健康志愿者尿液样本作为对照,筛选出不同严重程度AP患者尿液代谢谱变化的特征离子并进行物质鉴定,通过代谢通路等分析发现代谢物相关的生物学意义,进而初步分析这些代谢物质在AP的诊断及严重程度评估中可能所具有的潜在临床价值。方法:收集2017年7月至2017年12月苏州大学附属第一医院诊断为AP的67例住院患者尿液样本,其中MAP 40例,SAP 27例,另采集体检的30例健康志愿者尿液作为对照。采用液相色谱与质谱联用技术加以分析,检测不同严重程度的AP患者和健康对照者的尿液小分子代谢物。采用多元统计分析方法,构建主成分分析、偏最小二乘判别分析、正交-偏最小二乘判别分析等模型对样本和组间变异信息加以评估,并采用交叉验证、置换检验、以及训练集-测试集等方法对模型进行验证,初步评价分类模型的分类效果和预测能力。随后对差异代谢物进行筛选,采用PLS-DA第一主成分VIP值结合Mann-Whitney-Wilcoxon Test检验筛选差异代谢物,以p-value≤0.05且VIP≥1为有统计学意义。差异代谢物的鉴定首先根据精确分子量进行初步确认,推测其可能的分子式,然后依据MS/MS碎片信息比对公共数据库(Metlin,HMDB,massbank,Lipid Maps,Mzclound)确认差异代谢物。结果:本次实验正离子模式共获得893个前体分子,负离子模式获得1878个前体分子,由总离子流基峰色谱图可见,三组间代谢物离子峰值差异显著。PCA、PLS-DA、OPLS-DA三种模型都具有很好的可解释度(R2X>0.5)。由PCA得分图可以观察到,健康志愿者、MAP、SAP三组血浆样本具有一定的区分聚类趋势,获得了较好的分类模型。PLS-DA模型使组间对比的差异进一步凸显,三组样本呈明显的区分聚类,无论正负离子模式下,均有大于80%的样本符合模型判别(R2Y>0.8)且具有较高的可预测性(Q2>0.7)。在OPLS-DA模型中,随机抽取60%的样本(15个SAP样本,25个MAP样本,15个对照样本)作为训练集,用于构建OPLS-DA模型,40%的样本(12个SAP样本,15个MAP样本,10个对照样本)作为测试集,用于测试模型的可靠性。结果此组OPLS-DA分析共有5个主成分(2个预测主成分,3个正交主成分),在OPLS-DA得分图上清晰可见三组区分聚类愈发显著,且模型具有较好的拟合度和可预测度(R2X=0.318,R2Y=0.891,Q2=0.697)。同时测试集的样本均在图中能正确的归入分组聚类,经过训练集-测试集模型验证了该模型具有很好的分类效果和预测能力。共筛选并鉴定出20个差异代谢物,其中有14个代谢物在AP患者尿液中的浓度水平高于对照组,且在SAP组的浓度水平显著增高,它们分别是:3-甲基酮酸、苹果酸、肉碱、甲硫氨酸,赖氨酸,苯丙氨酸,亮氨酸,色氨酸、组氨酸、酮缬氨酸、酪氨酸,γ-谷氨酰苯丙氨酸、葡萄糖酸、犬尿氨酸。而腺苷的含量在AP患者尿液中的浓度水平低于对照组,且在SAP组的浓度水平显著下降。上述这15个差异代谢物在健康对照、MAP、SAP三组尿液的浓度水平变化特点,提示它们可能是反映AP严重程度的潜在差异代谢物。β-羟丁酸、琥珀酸半醛、氨基己二酸、CMPF(呋喃酸)在AP组浓度水平较对照组增加,且在MAP组显著增加,而SAP组低于MAP组浓度水平,提示这些可能是AP早期诊断的潜在代谢标志物或MAP的特征性标志物。胆碱在SAP组尿液的浓度水平显著高于MAP组和对照组,提示其可能是SAP的特征性代谢物质。结论:LC-MS代谢组学技术可以有效地识别不同严重程度AP患者尿液代谢物的变化,筛选出的差异代谢物对AP严重程度的分级可能具有潜在的临床应用价值。