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第一部分siRNA对肝星状细胞IGFBPrP1基因表达的抑制目的设计、化学合成2对针对大鼠胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBPrP1)基因的siRNA,研究对大鼠IGFBPrP1基因和蛋白表达的抑制作用,筛选出抑制作用较显著的一对IGFBPrP1 siRNA,用于后续实验中对大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)中IGFBPrP1功能的研究。方法1.应用10、30、50nmol/L化学合成的FAM-Negative siRNA转染HSC-T6细胞,转染后48h应用荧光显微镜评估其转染效率。2.30nmol/L IGFBPrP1 siRNA (siRNA1、siRNA2)和阴性对照分别转染HSC-T6细胞,培养48h后,采用荧光实时定量RT-PCR方法检测HSC-T6中IGFBPrPl基因的表达(β-actin作为内参照)3.30nmol/L IGFBPrP1 siRNA (siRNA1、siRNA2)和阴性对照分别转染HSC-T6细胞,培养48h后,采用Western blot方法检测HSC-T6中IGFBPrP1蛋白的表达(β-actin作为内参照)结果1.10、30、50nmol/L的FAM-Negative siRNA转染组细胞内均可见绿色荧光,对照组无荧光信号,30nmol/L和50nmol/L siRNA的转染效率明显高于10nmol/L组(P<0.05)；30nmol/L和50nmol/L siRNA组转染效率无显著差异(P>0.05),但50nmol/L组细胞死亡严重,转染效率约70%。2.30nmol/L IGFBPrP1 siRNA转染HSC-T6细胞,siRNAl组HSC中IGFBPrP1基因的表达水平明显低于阴性对照组和siRNA2组(P<0.01)3.30nmol/L IGFBPrP1 siRNA转染HSC-T6细胞,siRNA1组HSC中IGFBPrP1蛋白的表达水平明显低于阴性对照组和siRNA2组(P<0.01)结论1.化学合成的siRNA可以成功转染HSC-T6,30nmol/L的siRNA即可获得理想的转染效果。2.化学合成的2对siRNA转染HSC-T6 48h后,在mRNA水平和蛋白水平上,检测结果一致,其中siRNA1抑制作用显著。第二部分IGFBPrP1 siRNA对活化肝星状细胞分泌细胞外基质的影响目的利用化学合成的siRNA抑制胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBPrP1)基因的表达,研究其对肝星状细胞中细胞外基质表达的影响。方法选择大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)作为研究对象,分别设立正常对照组(加入等量PBS)、阴性对照组(转染Negative siRNA control或FAM-Negative siRNA作对照)和IGFBPrP1 siRNA干扰组(将筛选的抑制效率较高的siRNA以30nmol/L转染HSC-T6)。siRNA转染HSC-T6 72h后,收集各组细胞培养上清液并抽提细胞胞浆蛋白,采用Western blot检测HSC-T6胞浆蛋白中IGFBPrP1和培养上清液中Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白的表达。结果1. Western blot检测IGFBPrP1的表达：与正常对照组(0.42±0.03)和阴性对照组(0.40±0.03)相比,IGFBPrP1 siRNA干扰组IGFBPrP1的相对蛋白表达量(0.21±0.04)显著降低(F=48.018,P<0.01)。2. Western blot检测Ⅰ型胶原的表达：IGFBPrP1 siRNA干扰组Ⅰ型胶原的相对蛋白表达量(0.63±0.03)较正常对照组(0.61±0.03)和阴性对照组(0.35±0.05)显著减少(F=81.246,P<0.01)。3. Western blot检测纤维连接蛋白的表达：干扰组纤维连接蛋白的相对蛋白表达量(0.43±0.04)较正常对照组(0.76±0.07)和阴性对照组(0.74±0.05)明显降低(F=43.850,P<0.01)。结论1. IGFBPrP1 siRNA能特异性抑制IGFBPrP1在HSC-T6中的表达。2. IGFBPrP1具有调节HSC-T6中CollagenⅠ和FN合成和分泌的功能,进而导致肝纤维化的形成。第三部分IGFBPrP1与TGFβ1关系初探目的研究TGFβ1对HSC-T6中IGFBPrP1及细胞外基质表达的影响；通过应用siRNA阻断HSC-T6中IGFBPrP1基因的表达,观察TGFβ1对其的细胞外基质的影响,以阐明IGFBPrP1在肝纤维化中的作用地位。方法1.选择大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)作为研究对象,分别设立正常对照组(加入等量PBS)和TGFβ1处理组(加入终浓度为4ng/ml的TGFβ1)。TGFβ1作用24h后,采用Western blot法检测HSC-T6胞浆蛋白中IGFBPrP1和培养上清液中CollagenⅠ和FN表达的变化,并进行IGFBPrP1与CollagenⅠ和FN的相关性分析。2.将大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)分为3组：阴性对照组(转染Negative siRNA control或FAM-Negative siRNA作对照)、siRNA干扰组(将筛选的抑制效率较高的siRNA以30nmol/L转染HSC-T6)和siRNA+TGFβ1组(将抑制效率较高的siRNA转染HSC-T6,再加入TGFβ1刺激该HSC-T6)。TGFβ1作用24h后,采用Western blot法检测]HSC-T6胞浆蛋白中IGFBPrP1和培养上清液中TGFβ1、CollagenⅠ及FN表达的变化。结果1.TGFβ1对HSC-T6中IGFBPrP1、CollagenⅠ和FN表达的影响：TGFβ1处理组IGFBPrP1、CollagenⅠ和FN的相对蛋白表达量均较正常对照组显著增加(IGFBPrP1:0.58±0.09 vs 0.40±0.07,t=3.178,P<0.05；CollagenⅠ:0.79±0.08 vs 0.58±0.08,t=3.649,P<0.05；FN：0.84±0.09 vs 0.66±0.06,t=3.451,P<0.05)。IGFBPrP1的表达变化与CollagenⅠ及FN的表达变化呈正相关(r值分别为0.787,0.814,P<0.05)。2. IGFBPrP1 siRNA对TGFβ1刺激的HSC-T6中IGFBPrP1、CollagenⅠ、FN和TGFβ1表达的影响：siRNA干扰组IGFBPrP1、CollagenⅠ、FN和TGFβ1的相对蛋白表达量均较阴性对照组明显降低(IGFBPrP1:0.22±0.06 vs 0.40±0.03,F=19.384,P<0.01；CollagenⅠ：0.36±0.12 vs 0.61±0.09,F=14.711,P<0.05；FN：0.44±O.10 vs 0.75±0.11,F=25.591,P<0.05；TGFβ1：0.17±0.03 vs 0.23±0.02,F=7.321,P<0.05)；siRNA+TGFβ1组CollagenⅠ和FN的表达较阴性对照组(CollagenⅠ:0.79±0.12；FN：0.90±0.06)显著增加(P<0.05),IGFBPrP1和TGFβ1的表达无明显改变(P>0.05)；siRNA干扰组和siRNA+TGFβ1组相比,siRNA+TGFβ1组IGFBPrP1、CollagenⅠ和FN的表达明显增强(P值均<0.01),TGFβ1的表达无明显变化(P>0.05)。结论IGFBPrP1与致肝纤维化最强的细胞因子TGFβ1在肝纤维化发生发展中可能互为因果关系。