结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一。据统计,全球结直肠癌发病率和死亡率年均增长3.9%和4.0%。在美国,结直肠癌发病率占所有癌症的第四位,死亡率为第二位。2009年估计全美有106,100例结肠癌和约40,870例直肠癌的新发病例,而同年估计将有49,920例患者死于结肠癌和直肠癌。在我国,结直肠癌的发病率和死亡率分别位于恶性肿瘤的第3位和第4位,每年发病递增速度为世界平均值的两倍。面对如此严峻的形式,对结直肠癌的发生、发展进行更加深入的研究具有重要的意义。随着对肿瘤研究的深入,微电极系统和依靠核磁共振的影像学技术证实了间歇性缺氧是结肠癌、直肠癌等实体肿瘤的基本特征之一。缺氧诱导因子1-α(hypoxia inducible factor 1-α, HIF1-α)在肿瘤细胞对缺氧环境的适应中起到中心调控的作用,通过对肿瘤细胞的增殖、转录、凋亡、代谢、血管生成等方面的调节从而实现肿瘤细胞对缺氧环境的适应。此外,HIF1-α的目的基因包括与肿瘤增殖、浸润转移以及放化疗耐受等相关的关键因子。许多学者认为HIF1-α是一个肿瘤治疗理想的靶点,但研究表明大约2%的人类基因直接或间接地受HIF1-α的调控。因此,深入、全面的认识HIF1-α在间歇性缺氧环境下对肿瘤细胞的调控作用及其机制显得尤为重要。蛋白质组学能系统、全面地分析蛋白质的特性、数量及功能。通过观察特定干预因素下肿瘤组织或细胞蛋白质的表达变化,可以了解特定因素对肿瘤的作用及其机制。RNA干扰也因为其可以特异和高效的沉默肿瘤细胞靶基因而对正常细胞没有影响的特点,广泛的用于肿瘤的研究。本研究首先检测HIF1-α在结直肠癌中的表达情况以及HIF1-α对结肠癌细胞SW480生物学特性的影响;随后建立双向凝胶电泳技术,采用RNA干扰和蛋白质组学相结合的方法,检测沉默HIF1-α后蛋白表达的变化,寻找与HIF1-α作用相关的蛋白质;最后对部分差异蛋白在结直肠癌中的表达情况进行研究。第一部分HIF1-α在结直肠癌中的表达及其对结肠癌细胞SW480生物学特性的影响目的:探讨HIF1-α在结直肠癌中的表达;研究HIF1-α在常氧和间歇性缺氧环境下表达的变化及其对结肠癌细胞SW480生物学特性的影响。方法:免疫组织化学的方法检测HIF1-α在结直肠癌中的表达情况;利用免疫荧光、RT-PCR、Western blot检测结肠癌细胞SW480中HIF1-α在常氧、间歇性缺氧环境下表达的变化;采用RNA干扰技术沉默结肠癌细胞SW480中HIF1-α的表达,电镜及流式细胞术检测体外对细胞形态、凋亡的影响,裸鼠移植瘤检测体内对肿瘤生长的作用。结果:在结直肠癌中,HIF1-α阳性表达率为71.88%。在结肠癌细胞SW480中,HIF1-αmRNA及蛋白在常氧环境下的表达量较低,而在间歇性缺氧的环境下明显升高;沉默HIF1-α的表达,结肠癌细胞SW480凋亡明显增加,并能抑制裸鼠体内移植瘤的生长。结论:结直肠癌中HIF1-α蛋白的表达较高;结肠癌细胞SW480中HIF1-α在间歇性缺氧环境下明显增高,并对肿瘤细胞凋亡及移植瘤的生长有明显影响。第二部分蛋白质样品制备、双向凝胶电泳及图谱分析目的:探讨蛋白质样品制备、双向凝胶电泳的条件及方法,为RNA干扰HIF1-α的蛋白质组学分析奠定基础。方法:对双向凝胶电泳中样品裂解液、样品的制备方式进行优化,在不同蛋白上样量和聚焦强度下进行双向电泳,采用硝酸银染色,并对图像进行分析。结果:采用含有硫脲的裂解液进行蛋白提取,增加DNA酶及RNA酶单独作用时间,上样200ug蛋白,延长电泳时除盐时间,聚焦50000伏小时后,获得的电泳图谱分辨率和重复性均较好,分离蛋白点数超过1200个。面积和灰度值相差大于2倍的差异表达蛋白达23个,其中13个蛋白点在阳性干扰组明显下调,10个蛋白点在阳性干扰组明显上调。结论:成功建立了分辨率及重复性均较好的双向凝胶电泳技术,获得了清晰的双向凝胶电泳图谱。第三部分差异蛋白质的鉴定及验证目的:对RNA干扰HIF1-α基因的差异表达蛋白进行鉴定及验证,探讨HIF1-α在结直肠癌中的作用机制。方法:采用质谱及生物信息学对23个差异蛋白点进行分析、鉴定;Western blot对部分差异蛋白质的表达进行验证。结果:共鉴定出19种蛋白质,其中PRDX2等10种蛋白质在阳性干扰组明显下调,INPP5D等9种蛋白质在阳性干扰组明显上调。蛋白功能涉及到肿瘤细胞的分裂、增殖、凋亡、转化、迁移、能量代谢、信号传导、对缺氧环境的适应等方面。Western blot对PLD2、ANXA2及PRDX2蛋白水平的验证结果与蛋白质组学分析结果相一致。结论:HIF1-α对肿瘤细胞中多种因子进行调控,从而参与到肿瘤的发生、发展中。第四部分PRDX在结直肠癌中的表达及PRDX2可能的作用机制目的:探讨PRDX在结直肠癌及正常结直肠组织中的表达情况以及PRDX2可能的作用机制。方法:收集32例组织标本,采用免疫组织化学及Western blot的方法对PRDX在结直肠癌及正常结直肠组织中的表达情况进行检测;免疫共沉淀方法检测结肠癌细胞SW480中与PRDX2相互作用的蛋白质。结果:在正常结直肠组织中,PRDX1、PRDX2、PRDX3、PRDX5、PRDX6蛋白的表达微弱或缺失,PRDX4蛋白的表达阳性率为46.88%(15/32);在结直肠癌中,PRDX1蛋白的阳性表达率为65.63%(21/32), PRDX2蛋白的阳性表达率为71.88% (23/32),PRDX3、PRDX5和PRDX6蛋白的阳性表达率均为56.25% (18/32),PRDX4蛋白的阳性率仅为25.00% (8/32)。PRDX1、PRDX2、PRDX5的表达与III期结直肠癌患者或有淋巴结转移的患者之间有显著的相关性;PRDX1与PRDX2、PRDX3与PRDX4的表达间有显著的相关性。免疫共沉淀在结肠癌细胞SW480中获得了17种与PRDX2相互作用的蛋白质,其中有9种蛋白文献报道受c-Myc基因的调控。结论:PRDX在结直肠癌的发展、转移中发挥了一定的作用;PRDX2可能与c-Myc基因调控通路间存在密切的联系。