研究目的白血病干细胞(Leukemia stem cells, LSCs)是白血病化疗后复发的根源,现已明确白血病干细胞同造血干细胞一样定居在造血龛中。所谓造血龛主要是由骨髓基质细胞、成骨细胞、内皮细胞等组成的三维造血微环境。据研究发现,白血病干细胞可以与正常造血干细胞竞争造血龛,并将其改造成为适合自己生存的病态微环境,然后造血龛再通过多种作用机制使白血病干细胞停留在细胞周期G0期,逃避常规化疗药物杀伤作用。白血病干细胞要受到造血龛各种机制保护的前提是其必须稳定的锚定于这种微环境之中,而粘附分子及粘附分子受体就是将白血病干细胞固定在造血龛中的主要作用因子。因此,减少白血病干细胞粘附分子的表达可能会促使更多白血病干细胞脱离造血龛,进入增殖分裂周期,提高化疗药物的作用效果,这可能成为减少白血病化疗后复发的一个新途径。在造血干细胞细胞表面已发现20多种粘附分子,按这些粘附分子的结构特点可将其分成以下五类：(1)整合素家族；(2)免疫球蛋白超家族；(3)选择素家族；(4)粘蛋白样血管地址素；(5)钙粘着素或称钙离子依赖的细胞粘附分子家族；此外还有一些尚未归类的粘附分子,如CD44。VLA-4(CD49d)是整合素家族的一员,可与VCAM-1相互作用介导细胞间粘附；VLA-4(CD49d)是介导残留白血病和耐药的重要粘附分子,使用抗VLA-4(CD49d)单抗与化疗联用可消除小鼠模型中的残留白血病。CD44属于未分类粘附分子,主要配体是透明质酸,CD44可通过与受体结合的方式将白血病细胞锚定于骨髓造血微环境中,有利于白血病细胞的增值,阻止分化。靶向CD44的单抗可使白血病干细胞趋向于分化,这也证明通过阻断白血病细胞与造血龛之间的粘附作用可以克服分化受阻,诱导细胞成熟。Vermeulen等发现用抗体阻断粘附分子VLA-4(CD49d)和CD44可对小鼠造血干细胞进人骨髓的抑制程度达到77%-86%。因此我们选择CD49d、CD44作为观察指标。三氧化二砷具有诱导肿瘤细胞分化、凋亡及细胞毒等作用,用于治疗急性早幼粒细胞白血病取得了突出的疗效,使其可以获得治愈；有学者提出三氧化二砷可能通过降低PML基因而靶向清除慢性粒细胞白血病患者体内的白血病干细胞[1]。我们推测三氧化二砷可能通过某些机制靶向清除患者体内的白血病干细胞,从而避免化疗后复发,但在其他类型的白血病中,尚不明确三氧化二砷是否有协同清除白血病干细胞的作用。KGla细胞系来自急性髓系白血病细胞系,其分化程度低,细胞表型为CD34+CD38-,对集落刺激因子无反应性,被认为是造血干/祖细胞系,也是体外研究白血病细胞功能特性的有用模型。本研究拟用骨髓基质细胞模拟体外造血微环境,与KGla细胞共培养,观察三氧化二砷对KGla细胞表面粘附分子CD44、CD49d表达率的影响。实验方法1用全培养法分离骨髓基质细胞：在知情同意前提下,分别取正常人和白血病患者新鲜骨髓3-5mL,1000r/min,5min离心,去除脂肪块,加适量含10%胎牛血清的αMEM培养基混匀,37℃,5%CO2条件下培养。第2天半量换液,以后2-3天换液1次,待细胞局部融合覆盖瓶底≥80%时用0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代。2用正常人和白血病患者来源的骨髓基质细胞在体外模拟造血微环境,与KGla细胞共培养：取活性较好,第3-5代对数生长期骨髓基质细胞,按2×104/cm2接种于24孔板,37℃、5%CO2条件下培养24h,PBS洗去未贴壁细胞；KGla细胞调至1×105/mL,每孔2mL加入已铺骨髓基质细胞层上继续培养24h。3MTT法测定三氧化二砷对KGla细胞的半数抑制浓度(IC50)：对数生长的KGla细胞按10000个/孔接种于96孔板单独培养,分别在对照组和药物组中加入等体积PBS及不同浓度三氧化二砷(终浓度为0.50μmol/L,1.00μmol/L,2.00μnol/L,4.00μmol/L,8.00μmol/L),终体积200μL/孔,每组设4个复孔,同时设调零孔。培养24h后加MTT染液20μL/孔,继续孵育4h,离心并去上清,加DMSO150μL/孔,震荡,酶标仪测492nmol/L OD值。按以下公式计算细胞增殖抑制率。即细胞增殖抑制率(%)=[1-(药物组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)]×100%。用SPSS软件的probit analysis程序计算三氧化二砷作用24小时的IC50值,并确定实验用药物浓度。4用流式细胞术检测KGla细胞表面粘附分子CD44和CD49d表达率：4.1骨髓基质细胞对KGla细胞表面粘附分子表达的影响：4.1.1正常人及白血病患者来源的骨髓基质细胞对KGla细胞表面粘附分子表达的影响：实验分组：KGla细胞悬浮培养组(A组)；KGla细胞与正常人骨髓基质细胞共培养组(B组)；KGla细胞与白血病患者骨髓基质细胞共培养组(C组)。悬浮培养组只加入悬浮KGla细胞,后两个共培养组按方法2步骤铺板,培养24小时后收集KGla细胞。4.1.2白血病骨髓基质细胞与KGla细胞共培养不同时间后对粘附分子的影响：按方法2步骤建立体外造血微环境体系,分别培养24小时、36小时、48小时后收集KGla细胞。4.2不同浓度三氧化二砷对体外共培养体系中KGla细胞粘附分子表达的影响：按方法2步骤用白血病骨髓基质细胞建立体外造血微环境体系,实验分对照组及药物组(终浓度分别为0.25μmol/L,0.50μmol/L,1.00μmol/L,2.00μmol/L),对照组加入同体积PBS,继续培养24小时后收集KGla细胞。4.3三氧化二砷作用于体外共培养体系不同时间后对KGla细胞粘附分子表达的影响：按方法2步骤用白血病骨髓基质细胞建立体外造血微环境,选定终浓度为1.00μmol/L的三氧化二砷,分别作用24小时、36小时、48小时后收集KGla细胞。收集以上不同条件处理的KGla细胞,加入PE-anti-human CD49d及FITC anti-human CD44各5μL混匀,设同型对照组。室温下避光孵育30分钟,流式细胞仪计数10000个细胞检测CD44、CD49d表达率。5统计学分析：以上各实验均重复3次。采用SPSS17.0统计学软件包分析数据,计量资料数据记录格式采用均数±标准差(X±S)表示。用probit analysis程序计算三氧化二砷对KGla细胞作用24小时的IC50值,回归方程用拟合优度检验；不同处理组的CD44和CD49d表达率比较用单因素方差分析,组间多重比较用LSD法。显著性水准为a=0.05。实验结果1骨髓基质细胞形态学观察：全培养法培养至第10～12天时瓶底可见集落普遍形成,第15～20天形成单细胞层达融合生长。传代后细胞贴壁快,形态相对均一,约4-6天长满培养瓶底。将KGla细胞加入基质细胞层上培养24小时后,镜下可见局部呈铺路石样增殖。2MTT法测定三氧化二砷对KGla细胞的半数抑制浓度(IC50)：随着药物浓度的增加,三氧化二砷对KGla细胞生长有一定的抑制作用(F=2680.604,P=0.000)。用SPSS分析软件中probit analysis程序计算,三氧化二砷对KGla细胞作用24小时的IC50值为4.654μmol/L,95%可信区间为(3.634,5.715)μmol/L,(拟合优度检验X2=1.840,P=0.399)。为避免非凋亡性杀伤细胞太多,造成流式标本碎片太多而影响实验结果,本实验拟选用小于1/2IC50值为实验药物浓度(终浓度为0.25μmol/L,0.50μmol/L,1.00μmol/L,2.00μmol/L)。3用流式细胞术检测KGla细胞表面粘附分子CD44和CD49d表达率：3.1骨髓基质细胞对KGla细胞表面粘附分子表达的影响：KGla细胞悬浮培养组(A组)、KGla细胞与正常人骨髓基质细胞共培养组(B组)和KGla细胞与白血病患者骨髓基质细胞共培养组三组中KGla表面粘附分子CD44和CD49d表达率分别为93.50±0.85%和42.68±0.78%；98.31±0.50%和51.49±1.55%；99.13±0.43%和58.15±0.67%。三组差异有统计意义(F=71.487,P=0.000；F=155.98,P=0.000)。组间比较,B组和C组中KGla细胞表面粘附分子CD44、CD49d表达率均显著高于A组(P=0.000)；C组中KGla细胞表面粘附分子CD49d也明显高于B组(P=0.000)。但B组和C组之间KGla细胞表面粘附分子CD44表达率无显著性差异(P=0.159)。分别与白血病骨髓基质细胞共培养24小时、36小时、48小时后,KGla细胞表面粘附分子CD44和CD49d表达率为99.04±0.27%和58.32±1.07%；99.03±0.29%和57.92±0.80%；99.40±0.19%和59.52±1.72%。三个时间点间粘附分子表达率差异无统计学意义(F=2.139,P=0.199；F=1.318,P=0.335)。3.2不同浓度三氧化二砷对体外共培养体系中KGla细胞粘附分子表达的影响：在体外共培养体系中加入不同浓度三氧化二砷(0.25μmol/L,0.50μmol/L,1.00μmol/L,2.00μmol/L),随着药物浓度增加至2.00gmol/L时,KGla细胞表面粘附分子CD44和CD49d的表达率由99.22±0.21%和59.27±0.80%下降至85.25±0.50%和35.75±3.94%,有显著性差异(F=117.231,P=0.000；F=30.536,P=0.000)。组间比较,CD44表达率下降在各组之间均有统计学意义(P<0.05)；CD49d表达率在0.25μamol/L与0.50μmol/L组间(P=0.066)及0.50μmol/L与1.00μmol/L组间(P=0.106)差异无统计学意义。3.3三氧化二砷作用于体外共培养体系不同时间后对KGla细胞粘附分子表达的影响：1.00μmol/L三氧化二砷分别作用24小时、36小时、48小时后,体外共培养体系中KGla细胞表面粘附分子CD44和CD49d表达率分别为94.32±0.77%和46.14±0.81%；92.28±0.62%和41.66±1.07%；87.89±1.45%和34.40±1.62%。均呈下降趋势(F=31.494,P=0.001；F=71.054,P=0.000)。组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论(1)三氧化二砷可抑制KGla细胞生长,IC50值为4.654±mol/L,95%可信区间为(3.634,5.715)±mol/L。(2)骨髓基质细胞可上调KGla细胞表面粘附分子CD44及CD49d的表达；白血病骨髓基质细胞对CD49d表达率的上调作用强于正常骨髓基质细胞。(3)三氧化二砷可明显下调体外共培养体系中KGla细胞表面粘附分子CD44和CD49d的表达率,并且呈时间剂量依赖性。