低温酶在0°C-30°C的相对低温下能够发挥良好的催化活性,在生物技术、医药,和食品工业领域中有着广阔的应用前景。低温β-半乳糖苷酶（β-galactosidase,EC3.2.1.23）在乳品的冷藏温度（4°C）条件下能够很好的水解乳糖,因此在乳品脱乳糖中有很好的应用前景。筛选自天山1号冰川耐冷微生物Rahnella sp.R3（拉恩氏菌属）所产的低温β-半乳糖苷酶（R3-bgal）在4°C、中性pH条件下具有良好的催化乳糖水解的能力和稳定性。目前关于低温β-半乳糖苷酶筛选的研究颇多,但对于酶的更深层次的理化性质和结构信息等方面的研究仍有空缺。本论文基于Rahnella sp.R3来源的低温β-半乳糖苷酶,通过基因工程手段构建工程菌株,对重组酶进行系统的性质分析。同时,为进一步深入了解该重组酶,对其三维结构进行了详细的解析,为蛋白质进化和酶的工业化应用提供了重要的理论依据。主要研究内容和结论如下:（1）对来源于Rahnella sp.R3的低温β-半乳糖苷酶进行基因调取,并在不同的宿主中进行表达。通过简并引物结合染色体步移技术,得到一段全长为2064 bp的开放式阅读框,编码687个氨基酸,对该序列进行生物信息学分析,获取NCBI登录号KM486621。构建了三个重组表达载体,分别在E.coli BL21（DE3 pLySs）、Bacillus subtilis WB800N、Pichia pastoris SMD1168H三种表达系统中均实现重组酶蛋白的表达,并对三株重组菌诱导产酶条件进行了优化。（2）对三种重组酶进行分离纯化。结果表明,R3-bgal在大肠杆菌表达体系中表达效果最佳,其次为枯草芽孢杆菌表达体系,在毕赤酵母中产酶量最低。在大肠杆菌表达体系中,重组酶的比酶活为27 U/mg,单聚体分子量约为73 kDa,相对分子量约为225 kDa,为同源三聚体,属GH42家族酶类。对R3-bgal对天然底物乳糖和合成底物的水解性质研究,发现其最适作用温度为25°C,4°C可保持最高酶活的75%,在45°C以下具有良好的热稳定性。最适作用pH为7.0,在pH 5.5-8.0间具有较好的稳定性,不受到Na⁺,Ca²⁺离子的抑制,因此适合应用于牛乳中乳糖的水解。动力学研究结果表明,R3-bgal在4°C时对乳糖的亲和力较高（K_m=2.2?0.59）,葡萄糖对酶活无抑制作用,乳糖为非竞争性抑制。通过圆二色谱,研究了温度、pH值,和金属离子对酶的二级结构的影响。（3）采用气相扩散悬滴法筛选了R3-bgal的结晶条件,应用X-射线衍射解析得到了R3-bgal的三维结构。经432个条件的筛选,确认在蛋白质浓度为28 mg/m L;结晶母液组成为:0.2 M醋酸钠,0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）,30%w/v聚乙二醇（PEG）1500;防冻液为:50%结晶母液,50%w/v PEG400;20°C恒温恒湿条件下培养14-21天可得到满足X-射线衍射的晶体。晶体形状为六边形片状,最大尺寸约为0.1 mm x 0.35 mm。X-射线衍射100多个晶体后,得到最高分辨率为2.56?,可为蛋白质的三维结构提供丰富的信息。结构经解析后,发现每个晶格不对称单元中含两个酶分子,共有4099个氨基酸残基,32981个原子,6个锌离子,6个醋酸根离子,428个水分子。晶胞参数为a=146.43?,b=106.83?,c=164.24?;α=90.00°,β=109.0°,γ=90.00°,群空间为P12₁1。最理想区域内的氨基酸占总氨基酸数量的96%,在不理想范围内的氨基酸占0.5%。数据上传至PDB数据库,获得PDB ID:5E9A。（4）对R3-bgal三维结构进行详细分析。R3-bgal单个酶分子结构呈“花盆状”,上部开口直径约为40?,底部开口直径约为10?。每个单聚体由三个结构域组成。催化结构域具有典型的（β/α）₈ TIM-桶状结构,关键催化位点为E157和E314,催化机制为保留型。结构域B是维持R3-bgal必不可少的结构组成。结构域C是GH42家族β-半乳糖苷酶特有的结构域。通过对GH2家族已具有三维结构的β-半乳糖苷酶进行结构比对和分析,对R3-bgal的耐冷机制进行推测,发现分子内相互作用力和结构的柔性可能是影响GH42家族β-半乳糖苷酶温度适应性的重要因素。（5）利用离子诱导型凝胶的方法,通过两种阳离子(Ca²⁺、Mg²⁺)将R3-bgal固定于结冷胶水凝胶中。固定化后的水凝胶呈球形、表面光滑,机械强度高,两种固定化酶均能连续重复使用多次。经固定化后,酶的热稳定性大幅度提高,在低温（4°C）条件下能更好的发挥活性,在高温（>45°C）条件下能继续保持稳定;在碱性pH范围内更加稳定,最适作用pH维持7.0不变。通过扫描电子显微镜对冷冻干燥的水凝胶颗粒的表面及内部结构进行了研究,从结构上解释了两种不同固定化酶的差异性表现是由于两种阳离子的交联作用的不同导致的。结冷胶-钙（GG-Ca）固定化酶可有效的水解牛乳体系中的乳糖,4°C条件下添加0.8 U/mL的GG-Ca固定化酶可在7 h内水解牛乳中70%以上的乳糖。并且蛋白质和脂肪对酶的水解效果不会产生显著影响。