活性氧自由基(ROS)对细胞功能的调控发挥重要作用,与生物体的生理、病理过程和老化密切相关。近年来越来越多的证据表明,ROS介导了包括信号转导在内的多种生物学过程。同时大量研究发现ROS的过量产生与许多重大疾病的发生、发展联系紧密,例如神经退行性病变,手术中缺血再灌注损伤等。超氧阴离子自由基(O2·-)是第一个产生的ROS,而且能够转换为其他ROS (H2O2、ONOO等)。过氧化氢(H2O2)作为体内含量最高的ROS,是一种重要的信号转导分子,在老化和疾病中作为一种氧压标记物,同时也是对抗病毒入侵的防御物质之一。因此实时监测单一ROS(O2·-或H2O2)对揭示老化及多种疾病起着重要作用。同时,研究表明不同ROS之间(如O2·-与H2O2)以及ROS与其他生物小分子(如H+)是通过协同作用实现对细胞功能的调控。因此,为了在分子水平深入认识细胞事件中相关活性氧及相关联的活性分子的生物学作用,发展有效的工具对其在细胞水平进行实时地监测是当前迫切需要解决的问题。荧光成像技术具有高灵敏度、非侵入性、高时空分辨能力等明显优势,因此应用荧光显微成像可视化细胞内生物活性小分子是目前化学、生物学及医学领域研究的热点问题。然而,目前成像检测细胞内活性小分子的荧光探针仍存在诸多不足。例如：来自其他ROS对小分子荧光探针测定的干扰；响应时间较长；不可逆反应等。因此,设计合成具有高选择性、瞬时响应和可逆反应的荧光增强型探针,是目前检测活细胞及活体内活性小分子迫切需要解决的问题。与传统的单光子荧光成像方法相比,双光子荧光成像具有更深的样品穿透深度和更低的光损伤。因此,近年来发展了大量双光子荧光探针用于细胞及活体内生物活性分子的成像研究。但是用于动态可逆成像检测细胞及活体内O2·-的双光子荧光探针,以及同时检测O2·-与H2O2或O2·-与pH变化的双光子荧光探针还没见报道,这极大地阻碍了对这些活性小分子参与的细胞学过程的深入研究。基于以上原因,本论文设计合成了一系列新型的双光子荧光探针。实现了对细胞及活体内源性O2·-的动态可逆荧光成像检测、细胞内O2-/H2O2以及线粒体内O2·-/pH同时荧光成像检测,并初步探讨了ROS与生物体疾病、衰老之间的关系。本论文主要内容如下：1、设计、合成了一种动态可逆检测O2的双光子荧光探针TCA。该探针利用咖啡酸酯与O2的特异性识别反应,选择三聚氰胺作为探针骨架。TCA与O2反应后,咖啡酸残基邻苯二酚的给电子结构转变成吸电子的邻苯二醌结构(TCAO),探针分子的电荷分布发生改变,从而导致荧光变化。该探针能够高选择性地、动态地检测02,并且实现了对细胞及活体中O2-的可视化应用研究。TCA的线性范围为1.0×10-8-2.0×10-5M,线性方程是F=271.0O2·-(μM)+3578,线性相关系数为0.9950,检测限为2.3nM。该探针成功的实现凋亡刺激的细胞中的O2浮动的动态可逆荧光成像。而且,通过探针对缺血再灌注的肝细胞、斑马鱼和小鼠的单、双光子荧光成像的研究,使我们可以根据样品的不同厚度,方便的选择单光子或双光荧光模式成像,以获更准确、更清晰的细胞及活体荧光图像。2、设计合成了一种可逆的双光子荧光探针PY-CA,该探针具有高的双光子吸收截面积。能够高选择性、高灵敏度、动态可逆检测O2,而且荧光变化不受pH的影响。在之前工作的基础上,PY-CA的光学性能包括双光子吸收截面积被大幅提高,获得更佳的成像效果。探针PY-CA以苯乙烯基吡嗪(具有大的双光子吸收截面积)作为探针分子的骨架,在其末端共价偶联了两个咖啡酸分子作为O2的识别基团。PY-CA的线性范围是0-1.0×10-5M,线性方程是F=1276.84[O2-](μM)+547.07,线性相关系数为0.997,检测限为3.2nM。PY-CA成功的对HepG2细胞和肿瘤组织(深度为900gm)中的O2进行了可视化研究。通过对野生型秀丽隐杆线虫的荧光成像研究,发现O2水平与寿命之间是密切相关的。3、设计合成了一种同时检测O2/H202的同一激发不同发射的双光子荧光探针。该探针通过双色荧光的变化反映02和H202浓度的改变。在荧光显微镜的辅助下,有望揭示02和H202在细胞及活体中的相互关系及信号传导作用,探索活性小分子02和H202对细胞功能的协同调控作用。4、设计了一种定位于亚细胞器线粒体内同时检测02和pH的双光子荧光可逆探针。该探针有望揭示02和pH在细胞及活体中的相互关系及其在信号传导中的作用,超氧炫的存在与意义以及单一细胞器中不同活性小分子02和pH在时间、空间的关联变化规律。