【摘 要】
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基于糖类物质缺乏合适的检测方法,尤其是缺乏合适的临床药代动力学研究方法的难题,该论文利用杂交瘤技术,制备了特异性针对971的单克隆抗体,计划进一步用于其体内浓度的监测.
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基于糖类物质缺乏合适的检测方法,尤其是缺乏合适的临床药代动力学研究方法的难题,该论文利用杂交瘤技术,制备了特异性针对971的单克隆抗体,计划进一步用于其体内浓度的监测.首先是杂交瘤细胞株的建立,该文利用其结构组成完全相同的母体M来制备寡糖971的单克隆抗体.通过还原胺化法与过碘酸盐氧化法两种偶联方法的比较,确定了选用还原胺化法制备的M-牛血清白蛋白偶联物免疫的Balb/c小鼠进行细胞融合.将免疫小鼠脾细胞与NS-1小鼠骨髓瘤细胞系用PEG-4000进行融合,以971-卵清蛋白偶联物为包被抗原,ELISA法检测抗体,筛选阳性杂交瘤细胞;有限稀释法克勤克隆化三次后,建立了两株能持续分泌抗971单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为G3C5E8和G4D8E8.在获得971单克隆抗体杂交瘤细胞株的基础上,对细胞株及所分泌抗体的特性进行了研究.使用流式细胞仪测定了杂交瘤DNA含量,证明两株细胞均为融合细胞.经试剂盒检测得知G3C5E8和G4D8E8抗体亚型均为IgG<,1>,k型.抗971单克隆抗体经971阻断试验及竞争性抑制试验证明两株单克隆抗体对971具有特异性,而且与内源性多糖无交叉反应.杂交瘤细胞系经6个月以上的连续传代及反复冻融3次均能稳定分泌抗971单克隆抗体,而且所分泌抗体在37℃保存条件下,三天内仍能保持活性.接种杂交瘤至Balb/c小鼠诱发产生含特异性抗体的腹水.用饱和硫酸铵沉淀法纯化腹水中的抗体,并用Protein-G亲和柱层析纯化G3C5E8抗体,抗体纯化过程中较好的保持了抗体活性.SDS-PAGE电泳证明,所纯化抗体具有较高纯度.经SPR检测,纯化G3C5E8抗体与971结合的亲和力常数为5.19×10<-8>M.用SPR进行系列糖片段的竞争抑制作用研究,发现能与G3C5E8抗体结合的最小片段是4糖,但8糖与抗体结合能力更强.糖片段与抗体的结合能力呈长度依赖性,且6位羧基对抗原抗体结合起着重要作用.
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