【摘 要】
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目的:PLCD1（Phospholipase C delta 1）基因位于3p22,编码一种可以介导细胞能量代谢、钙离子稳态和细胞内运动的酶。PLCD1在几种类型肿瘤中发挥抑瘤作用,但其在肾细胞癌（RCC）中的表达与作用尚不清楚。本研究观察PLCD1在肾细胞癌中的表达情况,并探索PLCD1表达异常的原因,进一步揭示PLCD1在肾细胞癌中的作用与初步机制。方法:本研究通过生信分析PLCD1在肾癌组织
【基金项目】
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湖南省卫生健康委员会重点项目（202201043124）； 湖南省卫自然科学基金面上项目（2019JJ40254）；
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目的:PLCD1（Phospholipase C delta 1）基因位于3p22,编码一种可以介导细胞能量代谢、钙离子稳态和细胞内运动的酶。PLCD1在几种类型肿瘤中发挥抑瘤作用,但其在肾细胞癌（RCC）中的表达与作用尚不清楚。本研究观察PLCD1在肾细胞癌中的表达情况,并探索PLCD1表达异常的原因,进一步揭示PLCD1在肾细胞癌中的作用与初步机制。方法:本研究通过生信分析PLCD1在肾癌组织中的表达情况,RT-PCR验证PLCD1在肾癌细胞系中的表达;通过MSP与BGS实验检测PLCD1的启动子甲基化情况;对低表达PLCD1的肾癌细胞A498、HH244转染PLCD1过表达质粒后,通过CCK8、克隆形成实验检测细胞增殖能力,划痕、Transwell迁移实验检测细胞迁移能力,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力,流式实验检测PLCD1对肾癌细胞系的周期与凋亡影响情况,免疫荧光、蛋白印迹实验检测蛋白质的表达与细胞定位情况,双荧光素酶报告实验进行转录因子与启动子相互作用等机制探讨。结果:1.生信分析表明:PLCD1在肾癌中低表达,且PLCD1低表达患者预后较差;肾癌中PLCD1启动子高甲基化,且PLCD1启动子高甲基化患者预后较差。2.RT-PCR结果显示PLCD1广泛表达于包括肾在内的正常成人组织,PLCD1在大多数肾癌细胞系中低表达。3.MSP与BGS实验显示,肾癌细胞系中PLCD1低表达与启动子高甲基化相关。4.过表达PLCD1质粒转染肾癌细胞,结果显示:过表达PLCD1可以抑制肾癌细胞系的增殖、迁移、侵袭。5.Western Blot和免疫荧光检测结果都证实PLCD1能明显减弱肾癌细胞中Vimentin以及上调E-Cadherin的表达。6.流式实验显示PLCD1可使肾癌细胞阻滞于G2/M期,并诱导其凋亡。并且Western Blot检测显示PLCD1过表达细胞中凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3、Cleaved-PARP表达量升高。7.双荧光素酶报告基因结果显示PLCD1可抑制API、TOP Flash、WNT、P53、GRR5、SRE、PAI启动子元件。8.PLCD1可以抑制肾癌细胞中WNT/β-catenin信号通路及其下游靶基因cyclin D1、MMP7和c-Myc的启动子元件,并且与Western Blot结果相一致。9.Western Blot检测处理各组的ERK1/2、Src、EGFR、FAK的总蛋白与磷酸化蛋白情况,结果发现,过表达PLCD1时,其相应的磷酸化蛋白降低,信号通路受到抑制。结论:1、PLCD1在肾癌细胞中因启动子Cp G岛高甲基化而沉默。2、PLCD1可抑制肾癌细胞增殖、迁移、侵袭与EMT,诱导肾癌细胞G2/M期阻滞与凋亡。3、PLCD1可能通过负调控肾癌细胞中Wnt/β-catenin、EGFR-Src-ERK1/2和FAK-Src信号通路发挥抗肿瘤作用。
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