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复制起始位点的精细调控是基因组信息的准确传递和细胞周期协调运行的保证,DNA复制的起始是蛋白复制因子与复制子协同作用的结果,真核生物是如何选择其复制子及核小体定位是如何调控真核生物的复制起始,目前还不是很清楚。本文的工作包括YKN-10酵母细胞的同步化、复制起始序列301和305的活性验证及酿酒酵母Ⅲ号染色体不同复制起始活性序列形成核小体能力的比较,具体内容如下: 1.利用α因子停滞细胞生长法研究酿酒酵母细胞YKN-10的同步化,在0~5 h的细胞培养中分别加入浓度梯度为25~200μg mL-1的α因子,每隔0.5h在荧光倒置显微镜下观察酿酒酵母细胞的出芽形态,记录细胞的出芽率,然后用SPSS17.0对酵母细胞的出芽率进行统计分析,结果表明,α因子的浓度、α因子作用时间及二者的交互效应均对酵母细胞的平均出芽率有显著影响;α因子浓度在175~200μg mL-1下培养酵母细胞约3.5~4h时,酵母细胞基本上达到了同步化状态。运用α因子停滞细胞生长法获得了同步化的YKN-10酵母菌群体,为非Δbar1突变菌株的同步化研究提供了参考。 2.通过BrdU标记新合成 DNA的方法,验证酿酒酵母菌复制起始序列301和305的复制起始活性。对新合成DNA分别用BrdU标记5min、10min、15min和20min,提取酵母基因组,通过小鼠抗BrdU单克隆抗体和FITC-羊抗小鼠IgG抗体进行抗体免疫沉淀及纯化来富集新合成的DNA链,利用PCR技术验证DNA复制起始序列的活性。结果表明复制起始序列301不具有复制起始活性或具有较低复制起始活性,复制起始序列305具有一定的复制起始活性;标记5min和10min时,新合成DNA的长度为300bp和450bp左右。复制起始序列的活性鉴定为探究复制起始位点的选择机理奠定了基础。 3.将酿酒酵母Ⅲ号染色体上的10个复制起始序列分为高活性和低活性两组复制起始序列,利用核小体体外组装技术,将回收纯化的高活性和低活性复制起始序列分别与组蛋白八聚体在体外进行梯度盐透析组装形成核小体,并进行Biotin标记检测,然后用Image J软件分析不同复制起始序列组装形成核小体能力的强弱。结果表明,低活性复制起始序列较高活性复制起始序列更易形成核小体。研究酵母Ⅲ号染色体上的不同活性复制起始序列形成核小体能力对探究真核生物 DNA复制起始机制有着重要的生物学意义。