细胞外组蛋白与肝纤维化发生发展关系的实验研究

来源 :东南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liyongguang9280
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
肝纤维化源自各种原因导致的慢性肝损伤,可进一步发展为肝硬化,以细胞外基质(extracelluar matrix,ECM)过度沉积为突出特征,是人体对慢性肝损伤自我修复过程。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)激活被公认为肝纤维化发生的中心环节。重度肝损伤伴有显著的细胞凋亡和坏死,组蛋白主动或被动释放到细胞外,通过Toll样受体2/4/9通路加重肝局部炎症,并诱导中性粒细胞浸润活化,释放中性粒细胞外诱捕网(Neutrophil extracellular traps NETs),该网主要包括解聚的DNA、组蛋白和各种酶等,可诱导肝库普弗细胞高表达和释放白介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)等促炎因子及趋化因子,进一步加重肝脏损伤。但细胞外组蛋白是否能激活HSCs,促进ECM合成,从而导致肝纤维化的产生尚不清楚。目的了解CCl4诱导小鼠肝纤维化过程中及非抗凝肝素治疗后,动物肝损伤情况、循环组蛋白浓度变化。通过观察细胞外组蛋白和肝细胞、各种肝间质细胞相互作用,探究肝纤维化发生的新机及可能存在的信号通路。了解非抗凝肝素中和组蛋白对肝星状细胞胶原蛋白合成的影响以及对小鼠肝纤维化的抑制作用。观察组蛋白-TLR-MyD88信号通路对小鼠肝纤维化的影响。为进一步明确肝纤维化机制提供新的实验依据以及为临床治疗肝纤维化提供潜在靶点。方法第一部分:构建小鼠CCl4肝纤维化模型,非抗凝肝素皮下注射中和组蛋白毒性。Western blot法检测治疗组和模型组的循环组蛋白浓度变化,HE染色检测小鼠肝组织病理形态改变。第二部分:以不同浓度的细胞外组蛋白直接干预人肝星状细胞(HSC-LX2),再用细胞外组蛋白刺激人肝细胞(HL-7702)、PMA诱导后人单核巨噬细胞(THP-1)及人微血管内皮细胞(HMEC-1)后,取培养上清孵育星状细胞,Western blot检测HSC-LX2细胞的Collagen Ⅰ表达水平。免疫荧光染色显示胶原蛋白I和a-SMA表达情况。第三部分:(1)通过非抗凝肝素、细胞外组蛋白共同孵育LX2细胞,Western blot检测HSC-LX2细胞的Collagen Ⅰ表达水平。(2)通过构建CCl4肝纤维化模型,用非抗凝肝素阻断循环组蛋白毒性,HE染色显示小鼠肝组织病理形态,α-SMA免疫组化染色显示活化的肝星状细胞数量,天狼星红染色了解小鼠肝纤维化程度。(3)肝组织中羟基脯氨酸的检测定量纤维蛋白的含量。第四部分:(1)运用TLR 2/4阻断剂分别阻断LX2细胞和HMEC-1细胞上的TLR通路,Western blot检测Collagen Ⅰ表达水平的变化。(2)利用TLR-MyD88基因敲除小鼠构建CCl4肝纤维化模型,HE染色显示小鼠肝组织形态改变,α-SMA免疫组化染色显示活化的肝星状细胞数量,天狼星红染色了解小鼠肝纤维化程度。结果第一部分:模型组血浆组蛋白浓度在8小时达到高峰,其后下降;治疗组(肝素+CCl4组)血浆组蛋白浓度高峰延迟至20小时,其后下降。但随着干预时间延长,非抗凝肝素并不能降低组蛋白浓度。ALT水平及肝脏病理形态显示,非抗凝肝素组降低CCl4引起的肝损伤,减少炎症细胞浸润。第二部分:细胞外组蛋白长时间干预可以直接激活HSCs或通过持续刺激HL-7702细胞,间接激活HSCs,高表达Collagen Ⅰ,并有浓度依赖性。细胞外组蛋白短时间刺激HMEC-1细胞,也可间接激活HSCs,高表达Collagen Ⅰ。第三部分:体外实验发现,非抗凝肝素和组蛋白共同干预HSCs后,Collagen Ⅰ表达水平明显低于单用组蛋白的HSCs;体内实验发现,经非抗凝肝素干预后,小鼠肝脏组织内纤维间隔细而疏,显著轻于模型组,α-SMA免疫组化染色也显示干预组活化星状细胞数量较模型组减少。羟基脯氨酸的检测发现,CCl4注射在4周后造成羟基脯氨酸明显上升,用非抗凝肝素干预组,羟基脯氨酸明显降低,但仍然高于正常对照组。第四部分:TLR 2/4阻断剂阻断LX2细胞和HMEC-1细胞的TLR通路后,Collagen Ⅰ表达下降;TLR2、TLR4基因敲除小鼠肝脏坏死程度与野生型小鼠相当,但TLR4组炎症细胞浸润较少;MyD88基因敲除小鼠的炎症反应最轻。天狼星红染色结果显示MyD88组纤维化程度最轻,TLR2次之。结论CCl4在损伤肝细胞过程中,导致细胞内组蛋白大量释放,小鼠肝组织发生纤维化;非抗凝肝素可推迟组蛋白浓度到达高峰时间,但不能降低循环组蛋白浓度,提示非抗凝肝素对CCl4诱导小鼠肝纤维化有保护作用。细胞外组蛋白可以直接或通过肝内其他细胞激活HSCs,使Collagen Ⅰ表达增加。非抗凝肝素可以降低LX2细胞的Collagen Ⅰ表达水平,对CCl4诱导的小鼠肝纤维化有一定阻滞作用,提示细胞外组蛋白参与了肝纤维化的发生发展。细胞外组蛋白可能主要通过活化TLR-MyD88信号分子发挥促纤维化作用;TLR4组肝细胞变性坏死程度、纤维化程度与野生型小鼠相当,但炎症细胞浸润较少,提示该信号分子主要与炎症细胞浸润有关。
其他文献
学位
学位
学位
学位
学位
微机械谐振器是在共振频率下振动的微机电典型器件。微机械谐振器具有高精度、低延迟、大动态范围等优点。由于兼容集成电路制造工艺,同时又具有低成本、高集成度、功能多样化等诸多优势。品质因数是微谐振器最重要的性能参数之一,直接影响谐振器的分辨率和灵敏度等指标。品质因数由微谐振器中的固有阻尼和外部阻尼共同决定。外部阻尼,如空气阻尼、表面阻尼和锚区阻尼等可通过合理的设计或制造工艺消除。但固有阻尼,如热弹性阻尼
学位
学位
学位
随着时代的进步,人们的生活水平也在不断提高,人们对于精神品质的追求也越来越高。音乐作为一种特殊的艺术形式,在日常生活中的涉及领域十分广泛,对人的生活发展都具有显著的影响。随着教育事业的不断改革,小学阶段的音乐教学越来越受到学校和家长的重视,为了使学生拥有更高的音乐素养,使学生全身心地投入到音乐学习中,教师应该对教学方式进行创新,增强教学效果。