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目的：研究细胞衰老相关蛋白MRG15(MORF4-Related Geneonchromosome15)与迟发性脊椎骨骺发育不良蛋白Sedlin的相互作用。运用酵母双杂交技术,GSTpull-down技术,免疫荧光技术,免疫共沉淀的方法(co-immuno precipitation,CO-IP)检测MRG15蛋白和Sedlin蛋白的相互作用。 方法：采用酵母双杂交技术研究MRG15蛋白和Sedlin蛋白的相互作用,以人MRG15全长cDNA为模板,PCR法扩增人MRG15基因,将片段插入到pGADT7载体中,构建pGADT7-MRG15载体。将其与pGBKT7-Sedlin共同转化酵母菌AH109感受态细胞,SD(﹣Trp/﹣Leu/﹣His/+3-AT)X-α-gal培养基筛选蓝色的阳性克隆。 采用GSTpull-down方法检测MRG15蛋白和Sedlin蛋白在体外的相互作用。以人MRG15全长cDNA序列为模板,PCR扩增目的基因并在N端加FLAG标签,将带有标签的MRG15基因构建到pcDNA3.1载体上,构建MRG15真核表达载体pcDNA3.1-FLAG-MRG15。将转染pcDNA3.1-FLAG-MRG15的293T细胞裂解液同GST和GST-Sedlin融合蛋白共同孵育2h,GST珠子经洗涤沉淀后加SDS上样缓冲液沸水浴,将裂解液和沉淀物经SDS-PAGE电泳和免疫印迹后显现条带,用GST抗体和FLAG抗体分别印记。比较GST、GST-Sedlin和FLAG-MRG15的相对位置,从而验证在体外MRG15蛋白和Sedlin蛋白的相互作用。 采用间接免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)检测MRG15蛋白和Sedlin蛋白在哺乳动物细胞中的共定位情况。将pcDNA3.1-FLAG-MRG15和pcDGFP-Sedlin通过脂质体共转染到COS7细胞中,先后孵育一抗、二抗,利用不同标签蛋白在不同激发光下显示不同荧光,观察MRG15蛋白和Sedlin蛋白在COS7细胞中的定位。 采用免疫共沉淀的方法检测哺乳细胞内MRG15蛋白与Sedlin蛋白的结合情况。将pcDGFP-Sedlin和pcDNA3.1-FLAG-MRG15共同转染至HEK293T细胞,提取细胞裂解液,用FLAGM2单克隆抗体结合细胞裂解液中的MRG15及其结合蛋白进行免疫共沉淀,通过Westernblot法检测在MRG15蛋白与Sedlin蛋白的结合情况。 结果：酵母双杂交结果表明,共表达MRG15蛋白和Sedlin蛋白两种融合蛋白,细胞表现α-半乳糖苷酶活性,SD培养基上长出蓝色菌落,表明两种蛋白能够相互作用。GSTpull-down结果表明,MRG15和GST-Sedlin蛋白在体外能够结合。免疫荧光结果表明了MRG15蛋白主要分布在细胞核,Sedlin蛋白在胞质和细胞核中都有分布,二者在细胞核内有部分共定位。免疫共沉淀的结果表明,在HEK293T细胞中,MRG15和Sedlin能够相互作用。 结论：以上实验结果表明,MRG15蛋白与Sedlin蛋白可以相互作用,作用区域主要在细胞核内,结果提示Sedlin可能在细胞核中起到重要作用。