胆固醇作为动物体内最主要的固醇,参与体内多个关键的生理过程,如细胞膜的构成、蜕皮激素的合成等。昆虫为固醇合成缺陷型生物,一般通过取食获取生长发育所需要的大部分胆固醇。但是,植物体内几乎不含有胆固醇,植食性昆虫可将一些植物固醇转化为胆固醇。因此,植食性昆虫在与植物的协同进化中,不仅需要适应植物抗虫物质的变化,还需要具有代谢不同植物固醇的能力。不同昆虫吸收和代谢固醇的能力和效率以及对固醇的需求有很大的差异,这些特征及差异在害虫的防治中具有很大的意义。另外,并不是所有的植物固醇都能被代谢为胆固醇,例如在植物中也存在着一些非典型固醇,如烷醇和烷酮。它们虽然具有和胆固醇相似的结构,但昆虫却不能将这些固醇转化为胆固醇,并且还可能干扰胆固醇的正常功能,对昆虫的发育和繁殖造成不利的影响,甚至导致死亡,具有很好的抗虫潜能。目前,对粘虫[Mythimna separata（Walker）]固醇营养的代谢以及相关基因的研究甚少。本研究以固醇可控的半合成人工饲料为基础,探究了粘虫对不同含量、种类以及比例的固醇的适应性,筛选了参与非典型固醇胆甾烷酮代谢的基因,并在体内和体外证明了该基因在胆甾烷酮代谢中的重要作用,主要结果如下:1、粘虫对不同固醇的适应性分析不同含量和种类的固醇对粘虫幼虫的生长和存活具有不同的影响。1 mg/g胆固醇（1C）能满足幼虫的发育需求,随着饲料中胆固醇浓度的降低,幼虫的存活率显著降低。粘虫在不同固醇上的适应性为:胆固醇＞谷甾醇＞豆甾醇＞胆甾烷醇＞胆甾烷酮。胆甾烷醇（1A）能支持粘虫幼虫发育至蛹期,但同浓度下的胆甾烷酮（1K）导致全部幼虫在发育早期死亡。当胆固醇的浓度不足时（＜1C）,额外添加胆甾烷酮能显著提高幼虫的存活率和发育速率;当饲料中胆固醇足够时（1C）,添加一定量的胆甾烷酮（0-2K）不会影响幼虫的存活;GC-MS分析虫体固醇组成,发现饲喂胆甾烷酮饲料的粘虫体内含有大量的胆甾烷酮的还原产物:胆甾烷醇和表胆甾烷醇。因此,固醇浓度、种类和比例均会对粘虫的生长和存活产生影响,并且粘虫具有一定的代谢胆甾烷酮以降低其毒性的能力。2、粘虫胆甾烷酮代谢基因的筛选及序列分析根据前人对美洲棉铃虫代谢胆甾烷酮基因的研究和对粘虫转录组的分析,在粘虫中筛选出了8个可能参与胆甾烷酮代谢的基因,分别是醛酮还原酶、泛素连接酶和酰基载体蛋白还原酶。其中醛酮还原酶Mse29229基因为肠道高表达基因,并且该基因在饲喂胆甾烷酮的粘虫幼虫中,在转录水平显著上调。通过与AKR家族所有成员进行同源性分析并根据AKR superfamily命名规则,将该基因命名为AKR2E9。在线同源建模预测该蛋白具有AKR家族典型的（α/β）8-TIM桶状结构以及位于桶中心的催化四分体（Asp70-Tyr75-Lys104-His137）。以多肽为抗原制备了检测AKR2E9蛋白的高效价特异抗体,AKR2E9蛋白表达量在饲喂胆甾烷酮的幼虫肠道中显著高于饲喂胆甾烷醇的幼虫。另外,在的唾液和肠腔中均未检测到AKR2E9蛋白,但在肠道细胞中检测到,说明AKR2E9对胆甾烷酮的还原可能发生在肠道细胞中。3、AKR2E9原核表达及体外功能验证通过原核表达系统得到了大量的可溶的His-AKR2E9融合蛋白,进一步对蛋白进行纯化和浓缩,最终得到浓度为10 mg/g的纯化蛋白。用多克隆抗体对表达的His-AKR2E9蛋白进行Western blot分析,结果显示粘虫AKR2E9蛋白成功表达。醛酮还原酶（AKRs）是一类依赖NADPH的能把羰基还原为羟基的还原酶,因此,我们构建了以胆甾烷酮为底物,NADPH为辅因子的反应体系,在添加His-AKR2E9蛋白的产物中检测到了胆甾烷酮的代谢产物胆甾烷醇,表明通过原核表达系统表达的His-AKR2E9蛋白具有体外的胆甾烷酮还原活性。4、粘虫CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立本实验以无内含子的NPC1b基因为靶标,首次在粘虫上建立了CRISPR/Cas9基因编辑系统。通过产卵实验发现粘虫雌虫日产卵量和卵孵化率均呈现先升高后降低的变化规律;在羽化后的第5-7天,日产卵量达到峰值且具有较高的孵化率,并且雌虫在黑暗周期前3小时内集中产卵。以0.1%Na Cl O作为洗脱液洗卵,对卵孵化影响最小。特别值得注意的是,与其它鳞翅目卵注射不同,在注射时和注射后对卵进行保湿,能显著提高卵的孵化率。在产卵后6 h内完成注射,敲除效率为100%,另外,在较早的时间注射,如＜2 h,能提高卵孵化率和敲除效率。5、粘虫AKR2E9基因突变对胆甾烷酮代谢能力的影响本实验通过分析比较多个鳞翅目昆虫AKR家族成员的基因结构,获得了AKR2E9基因部分外显子/内含子结构信息。通过双靶点敲除策略对AKR2E9基因进行大片段敲除,并通过多代杂交筛选获得了AKR2E9基因突变纯合品系AKR2E9-/-。相比于野生型,AKR2E9-/-幼虫在胆甾烷醇饲料上的生长和野生型无明显差异,但在胆甾烷酮饲料上的适应性降低。通过GC-MS分析发现,相较于野生型,AKR2E9-/-虫体内胆甾烷酮含量增加,代谢产物含量降低,代谢胆甾烷酮能力下降。另外,和野生型相比,AKR2E9-/-幼虫在添加胆固醇氧化酶（COD）的胆固醇饲料上存活率显著降低,但是在添加胆固醇氧化酶（COD）的胆固醇油酸酯（CO）饲料上没有显著差异,进一步说明了AKR2E9基因在粘虫代谢酮类固醇中的重要作用。本部分实验通过构建AKR2E9基因突变纯品系,验证了AKR2E9基因在粘虫代谢胆甾烷酮中的重要作用。综上所述,本研究首次探究了粘虫对不同固醇的适应性,鉴定并证明了醛酮还原酶AKR2E9在粘虫对非典型固醇胆甾烷酮解毒中的重要作用,为基于固醇营养的粘虫绿色防控技术提供了理论依据。另外,通过优化粘虫卵的注射方法等技术条件,在粘虫上建立了CRISPR/Cas9基因编辑系统,为利用CRISPR/Cas9系统研究粘虫基因功能提供了技术支持。