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研究背景:慢性髓细胞性白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种造血干细胞的恶性克隆性疾病,其发病机制为染色体易位t(9;22)(q34;q11),由于bcr基因断裂点的不同,产生不同的bcr/abl融合基因,CML最主要的是b3a2这一型融合(95%以上),其表达的P210BCR/ABL融合蛋白具有异常增强的酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosinekinase,PTK)活性,通过改变造血细胞内一系列信号传导途径,调控细胞的粘附、增殖和凋亡,导致细胞恶性扩增而致病。因此探索有效抑制bcr/abl融合基因,下调P210BCR/ABL的形成,或拮抗P210BCR/ABL的PTK活性以及阻断P210BCR/ABL介导的传导通路等已成为治疗的新策略。人工合成的P210BCR/ABLPTK抑制剂(TKI)甲磺酸伊马替尼(ST1571,商品名格列卫),可特异性阻断P210BCR/ABL的酪氨酸激酶活性,在CML临床应用中已取得良好疗效,使CML的治疗进入一个新的时代。然而,有部分病人出现不能耐受的毒副作用,还有部分病人逐渐出现耐药,耐药的主要原因为bcr/abl基因上的点突变、bcr/abl基因过度扩增和表达,虽然目前第二代的酪氨酸激酶抑制剂尼洛替尼、达沙替尼能解决大部分耐药问题,但难免也会逐渐出现耐药,而且这种TKI的作用靶点是bcr/abl融合基因下游的融合蛋白,并不能真正解决bcr/abl融合基因之病根,理论上说不能治愈CML,因此针对bcr/abl融合基因作为理想分子靶点的基因治疗也是研究的热点之一。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是最近十几年发展起来的一项新兴的在转录后水平的基因阻断技术,与以往的基因阻断技术比较,如基因敲除、反义寡核苷酸技术等,RNAi更具有快速、有效和序列特异性强等优点。已有研究证明,针对bcr/abl mRNA融合位点设计的siRNA能够显著下调K562细胞中bcr/abl基因表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。但是这种体外化学合成的siRNA很容易降解,不稳定,产生的RNAi效应短暂。筛选高效siRNA和使之持久稳定的表达,利用真核表达载体在哺乳动物细胞内合成表达有发卡结构的siRNA,是体外合成siRNA有效的替代方案,这种方案更接近生物体产生RNAi现象的自然机制并有可能用于基因治疗。本实验利用本课题组先前构建好的一系列可包含1～6个siRNA表达单位的表达型载体,首先设计构建针对bcr/abl融合基因的单一siRNA真核细胞表达载体,转染K562细胞株,检测细胞株bcr/abl mRNA及BCR/ABL融合蛋白的表达水平,证实该表达载体能在细胞内发生作用,并对bcr/abl基因有干扰效应;然后在此研究基础上,我们设计构建针对bcr/abl融合基因的多重siRNAs表达型载体,来放大和强化这种siRNA的RNAi效应,为进一步探索CML的基因治疗提供一种新的手段。目的:构建针对bcr/abl融合基因的多重siRNAs真核表达载体,为进一步探索siRNA的体内研究及CML基因治疗的新策略,提供一种技术手段。方法:第一部分bcr/abl融合基因单个siRNA真核表达载体的构建与鉴定1. K562白血病细胞株在加有10%胎牛血清的RPMI1640培养基,5%CO2条件下37℃培养。2.根据文献已证实有效的、针对bcr/abl基因特异性siRNA序列,将模板序列克隆至p1-siRNA质粒中,并酶切、测序鉴定。3.用脂质体LipofectamineTM LTX将测序正确的重组子转染至K562细胞株中,利用RT-PCR、Western Blot方法检测转染后细胞株中bcr/abl mRNA和BCR/ABL融合蛋白的表达水平,以及通过MTT法检测转染后细胞增殖情况和使用Annexin V联合PI法流式细胞仪检测细胞凋亡情况,这样不仅再次验证所选siRNA序列的有效性,同时也证明我们所选用的这一siRNA真核表达载体系统的有效性。第二部分bcr/abl融合基因的多重siRNAs真核表达载体的构建在上述证实siRNA序列和siRNA表达载体系统有效的基础上,重复性将相同的和不同的siRNA接入含多个siRNA表达单位的载体p6-siRNA中,构建针对bcr/abl基因的多重siRNAs真核表达型载体。结果:1.经酶切、测序验证,bcr/abl融合基因的siRNA真核表达载体的模板序列与设计序列完全正确,成功构建p1-siRNA1、p1-siRNA2和p1-siRNAn质粒。2.通过阳离子脂质体LipofectamineTM LTX将p1-siRNA1和p1-siRNA2、p1-siRNAn质粒以及GFP阳性对照质粒瞬时转染到K562细胞株中,经荧光显微镜观察绿色荧光,估计转染效率:约30%。3.转染特异性质粒p1-siRNA1和非特异性质粒p1-siRNAn的K562细胞株比较:bcr/abl mRNA水平降低了27.6%,BCR/ABL蛋白表达水平下降了30.6%;再比较相应的细胞增殖抑制率和细胞凋亡率,分别为40.1% vs 16.5%和9.65% vs 1.79%。同样,简单地比较了转染特异性质粒p1-siRNA2和非特异性质粒p1-siRNAn的K562细胞株的bcr/abl mRNA水平降低了28.7%。由以上结果证明所选择的两个siRNA序列和siRNA真核表达载体系统确实有效,因此可以继续构建bcr/abl融合基因的多重siRNA真核表达载体。4.经酶切、测序验证,bcr/abl融合基因的多重siRNA真核表达载体的模板序列与设计序列完全正确,成功构建针对bcr/abl融合基因的多重siRNAs真核表达载体。结论:1.我们所构建的针对bcr/abl融合基因siRNA真核表达载体p1-siRNA1质粒通过阳离子脂质体LipofectamineTM LTX转染到K562细胞株中,经RT-PCR和Western Blot、MTT试验以及流式细胞仪等方法分析,结果表明针对bcr/abl基因的siRNA真核表达载体p1-siRNA1和p1-siRNA2对K562细胞株具有一定的干扰效果。说明这一种表达型载体能在细胞内产生RNA干扰效应。2.我们在上述研究的基础上,设计构建多重的siRNAs真核表达载体,经测序验证,针对bcr/abl融合基因多重siRNAs真核表达载体构建成功,可用于后续的实验,为进一步研究探索CML基因治疗提供工具。