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背景:冠状动脉微栓塞(Coronary Microembolization,CME)是由冠状动脉粥样斑块自发破裂或冠心病介入治疗(PCI)过程中微小栓子造成的冠状动脉微循环栓塞和心肌微梗死,是远期主要心血管不良事件发生的强烈预测因子。CME发生后多条凋亡通路激活,梗死相关区域心肌细胞明显凋亡,并诱发心功能障碍,称为CME后心肌损伤。P53是一种重要的凋亡相关基因,参与凋亡启动过程,通过Bbc3等效应因子参与死亡信号受体蛋白途径、Bax/BCL-2、NF受体和Fas蛋白等途径完成对细胞凋亡的调控作用。心肌缺血再灌注时心肌组织p53表达量上调,抑制线粒体凋亡通路后心肌细胞凋亡减少,p53表达量也相应下调。然而,CME发生时p53是否激活线粒体凋亡通路,以及通过干预p53是否能调控CME导致的心肌凋亡尚不明确。MicroRNAs(miR,miRNAs)通过促使mRNA水解或抑制其翻译作为基因表达的负调控因子。miRNAs也参与细胞凋亡。然而miRNA能否在心肌细胞中干预p53-Bbc3介导的线粒体凋亡通路尚不明确。因此,本研究旨在观察大鼠CME后及离体心肌细胞诱导凋亡后miR-486、p53表达水平及其与BCL-2相关线粒体凋亡通路的动态联系,并操作miR-486、p53基因表达水平,以揭示其在CME导致心肌细胞凋亡及心功能障碍中的作用。第一部分冠状动脉微栓塞过程中miR-486、p53的表达动态变化及其与心肌凋亡、心功能障碍的关系目的:本实验通过建立大鼠冠状动脉微栓塞(coronary microembolization,CME)模型,观察心肌细胞凋亡及CME致心功能损伤时与miR-486、p53表达的动态变化及关系。方法:12只SD大鼠随机分为冠状动脉微栓塞组(CME组)与假手术组(sham组),每组均为6只。经左心室注入微栓塞球构建CME模型组,假手术组注射生理盐水代替微栓塞球。建模前及建模8小时后超声测定心功能,建模8小时后取左心室心肌组织,TUNEL染色评估心肌凋亡指数,RT-PCR和western blot检测miR-486、p53,Bbc3的基因和蛋白相对表达量。结果:CME组相比sham组,p53,Bbc3表达量增多(P<0.05),miR-486表达量减少(P<0.05),心肌凋亡指数升高(P<0.05),CME组左室射血分数(LVEF)均较Sham组明显降低(P<0.05),并伴随着左室短轴缩短率(FS)和心排血量(CO)下降(P<0.05)。Spearman直线相关分析发现,miR-486表达量与心肌细胞凋亡指数呈负相关,与LVEF负相关;p53表达量与心肌细胞凋亡指数呈正相关,与LVEF正相关;Bbc3表达量与心肌细胞凋亡指数呈正相关,与LVEF正相关;miR-486与p53表达量负相关,p53与Bbc3表达量正相关。结论:miR-486、p53均参与了CME导致的心肌损伤,并呈现出明显相关性,其可能是通过调控心肌Bbc3的表达参与这一过程。第二部分P53/Bbc3/BCL-2信号转导通路在大鼠冠状动脉微栓塞致心肌损伤中的作用研究目的:心肌细胞凋亡是冠状动脉微栓塞(coronary microembolization,CME)导致心功能损伤的主要原因之一,而p53是重要的细胞凋亡调节因子,可以通过应激多条凋亡通路,诱导细胞的生长阻滞,细胞凋亡。然而它在CME中的作用尚不清楚,因此本研究旨在探索CME后p53通过Bbc3激活BCL-2相关的线粒体凋亡通路引发心肌凋亡及心功能损伤的机制。方法:40只SD大鼠随机分为微栓塞组(CME组)、假手术组(sham组)、CME+si RNA-p53组、CME+control-p53组,每组10只。经左心室注入微栓塞球构建CME模型组;假手术组注射生理盐水代替微栓塞球;CME+si RNA-p53组于CME前14天经大鼠尾静脉注入搭载p53-si RNA序列的腺相关病毒,CME+control-p53组于CME前14天经大鼠尾静脉注入搭载control-si RNA序列的腺相关病毒。应用心脏超声检测心功能指标;末端脱氧核糖核酸转移酶介导的d UTP切口末端标记技术(TUNEL)检测心肌细胞凋亡;荧光定量PCR与western blot检测心肌组织p53,Bbc3,BCL-2,cleaved caspase-3表达。结果:超声心动图结果与sham组比较,CME组心功能显著降低(P<0.05);与CME组比较,CME+control-p53组心功能无明显差异(P>0.05),而CME+si RNA-p53组心功能显著改善(P<0.05)。病理学显示,与sham组比较,CME组心肌细胞凋亡指数明显增加(P<0.05);而与CME组比较,CME+si RNA-p53组心肌细胞凋亡指数明显降低(P<0.05)。荧光定量PCR与western blot结果显示,与sham组比较,CME组心肌组织p53,Bbc3及cleaved caspase-3表达量均显著增多(P<0.05),但BCL-2表达下降(P<0.05);与CME组比较,CME+si RNA-p53组心肌组织p53,Bbc3和cleaved caspase-3表达量明显降低,而BCL-2表达增加。结论:P53参与了CME导致的心肌损伤,可能是通过上调Bbc3,从而激活BCL-2/caspase3相关的线粒体凋亡通路引发心肌凋亡。下调p53表达可以有效抑制该通路,从而减少心肌凋亡和心功能障碍。第三部分Micro RNA-486调控p53/Bbc3/BCL-2相关线粒体凋亡通路参与心肌细胞凋亡机制目的:心肌细胞凋亡是多种心脏疾病的共通的病理表现。本研究旨在探索micro RNA-486(miR-486)通过干预p53活化的线粒体通路以调控心肌细胞凋亡的机制。方法:体外培养SD大鼠乳鼠原代心肌细胞,分别转染miR-486模拟物、抑制物以及相应对照序列,操作其表达水平,并以H2O2诱导细胞凋亡。以流式细胞术和TUNEL染色检测心肌细胞凋亡水平,RT-PCR及western-blot检测miR-486,p53,Bbc3,BCL-2及cleaved caspase-3相对表达量。结果:miR-486过表达后p53、Bbc3和cleaved caspase-3表达量均显著下降(P<0.05),BCL-2表达量明显增加(P<0.05),心肌细胞凋亡率减低(P<0.05)。miR-486沉默后p53、Bbc3和cleaved caspase-3表达量上升(P<0.05),BCL-2表达抑制(P<0.05),心肌细胞凋亡率升高(P<0.05)。结论:miR-486有可能通过p53介导的粒体凋亡通路调节心肌细胞凋亡过程。通过上调心肌细胞中miR-486的表达量,可以有效的减少线粒体凋亡通路激活从而保护心肌细胞。第四部分Micro RNA-486调控p53/Bbc3/BCL-2相关线粒体凋亡通路防治冠状动脉微栓塞心肌损伤的研究目的:多种micro-RNA在冠状动脉微栓塞(CME)致心肌损伤中具有调控作用。本研究旨在探索micro RNA-486(miR-486)通过干预p53活化的线粒体通路防治心肌损伤的功能。方法:40只SD大鼠随机分为微栓塞组(CME组)、假手术组(sham组)、CME+miR-486 up组、CME+miR-486 up control组,每组均为10只。CME+miR-486 up组及CME+miR-486 up control组分别经尾静脉注射搭载miR-486序列及control序列的腺相关病毒注射液,14天后构建CME模型及假手术模型。应用心脏超声检测心功能指标;TUNE检测心肌细胞凋亡;荧光定量PCR与western blot检测心肌组织p53,Bbc3,BCL-2,cleaved caspase-3表达。结果:与sham组比较,CME组心功能显著降低(P<0.05);CME组与CME+miR-486 up control组心功能无明显差异(P>0.05),而CME+miR-486 up组相比CME组心功能显著改善(P<0.05)。TUNEL示CME组心肌细胞凋亡指数较sham组明显增加(P<0.05);CME+miR-486 up组心肌细胞凋亡指数相比CME组可明显降低(P<0.05)。与sham组比较,CME组心肌组织p53,Bbc3及cleaved caspase-3表达量均显著增多(P<0.05),但BCL-2表达下降(P<0.05);CME+miR-486 up组相比于CME组心肌组织p53,Bbc3和cleaved caspase-3表达量明显降低,而BCL-2表达增加。结论:miR-486可以通过干预p53/Bbc3/BCL-2/caspase-3相关的线粒体凋亡通路参与调控CME导致的心功能损伤。通过上调心肌细胞中miR-486的表达量,可以有效减少心肌凋亡和心功能障碍。