脑胶质细胞瘤是中枢神经系统中对人类危害最大的肿瘤,其恶性增殖和侵袭性生长特性是导致患者术后肿瘤复发、预后较差以及生存期短的主要原因。目前国际上普及以手术切除为主,放、化疗为辅的综合性治疗措施,但仍未能从根本上遏制肿瘤的发展和提高患者的生存质量。为了能彻底攻克这一顽疾,神经科学工作者对胶质细胞瘤的发生、发展以及演进机理的研究日趋深入。近年来,多项临床回顾性和前瞻性研究结果均表明, YKL-40是一种在人类恶性肿瘤中极具预后诊断价值的标记物。这一“哺乳动物甲壳酶样蛋白”家族成员在多种局限性生长或转移性生长的恶性肿瘤患者血清中的高表达,可以揭示患者的预后不良。在脑胶质细胞瘤患者中,血清YKL-40的表达水平同肿瘤级别与瘤荷密切相关,围绕这一主题的相关研究主要集中在对血清YKL-40的表达与脑胶质细胞瘤患者的预后,以及对术后放疗的反应性和生存质量的分析之中。然而,对YKL-40在脑胶质细胞瘤发生和演进过程中所扮演的角色及涉及的相关机制还很不清楚。基于此,本研究从以下几个方面初步探讨了YKL-40在脑胶质细胞瘤增殖过程中的作用机理,并探寻以下调其表达为靶向的治疗方式应用于临床的可行性。1. YKL-40蛋白在WHO I- IV级脑胶质细胞瘤中的表达及意义通过收集210例WHO I~IV级脑原发性星形胶质细胞瘤组织标本,其中WHO I级11例,均为毛细胞型星形细胞瘤( Pilocytic astrocytoma, PA );WHO II级69例,均系弥漫型星形细胞瘤( Diffuse astrocytoma, DA );WHO III级62例,均系间变性星型细胞瘤( Anaplastic astrocytoma, AA );WHO IV级68例,均为多形性胶质母细胞瘤( Glioblastoma multiforme, GBM )。采用免疫组织化学染色法检测YKL-40蛋白在各级星形胶质细胞瘤中的表达,并进一步对比分析YKL-40蛋白表达与脑胶质细胞瘤恶性级别的关系及其在肿瘤各类别间表达的差异性。结果显示,YKL-40蛋白在人脑胶质细胞瘤中呈现高表达,其表达阳性率在WHO I~IV级间差异非常显著(χ~2=69.151,P=0.00 < 0.01 ) ,其中I、IV级间(χ~2=66.211,P=0.00 < 0.01 ) ;II、IV级间(χ~2=61.226,P=0.00 < 0.01 ) ;III、IV级间(χ~2=26.055,P=0.00 < 0.01 ) ;II、III级间(χ~2=9.651,P=0.002 < 0.01 )和I、III级间(χ~2=9.252,P=0.002 < 0.01 )差异均非常显著。其免疫反应评分( Immunoreactivity score, IRS )在脑胶质瘤I~IV级病理级别间差异也非常显著( P=0.000 < 0.01 ) ,其中I、IV级间( P=0.00 < 0.01 ) ;II、IV级间( P=0.00 < 0.01 ) ;III、IV级间( P=0.00 < 0.01 ) ;II、III级间( P=0.00 < 0.01 )和I、III级间( P=0.00 < 0.01 )差异均非常显著;I、II级间差异显著( P=0.029 < 0.05 )。这说明YKL-40蛋白的表达随胶质细胞瘤病理级别的增高而明显升高。YKL-40蛋白在GBM中表达阳性率与IRS较星形胶质细胞瘤其它类型( PA, DA, AA )存在显著差异( P<0.01 )。对210例星形胶质细胞瘤的免疫组织化学分析结果表明, YKL-40蛋白的高表达与脑胶质细胞瘤的病理分级和组织分型密切相关。2. YKL-40 SiRNA对人脑胶质瘤细胞体外生物学功能的影响首先筛选体外4种脑胶质细胞瘤细胞系: U87、U373、A172、T98及原代培养胶质瘤细胞5例:Case 1,Case 2,Case 3,Case 4,Case 5,其中YKL-40蛋白表达最高者为U87细胞,原代培养Case 2和Case 5细胞。实验中进行YKL-40 SiRNA瞬转,特异性沉默YKL-40基因,并采用WST-1法,流式细胞仪碘化丙啶染色法和Matrigel体外侵袭实验,分别检测YKL-40基因沉默后脑胶质瘤细胞的增殖力、瘤细胞周期分布与瘤细胞体外侵袭力的改变。WST-1检测细胞增殖结果显示,在时间窗48 h,72 h和96 h,U87-Si,Case 2-Si,Case 5-Si组细胞较对照组差异非常显著( P均< 0.01 )。FCM碘化丙啶染色法测定细胞周期结果表明, 86.59%±0.56%的U87-Si组细胞滞于G0/G1期,较U87 ( 72.58%±0.82% )和U87-Co ( 74.09%±0.60% )组细胞具有显著差异( P均< 0.05 )。Matrigel体外侵袭实验中,侵袭小室经割膜和HE染色细胞计数后发现, U87-Si组细胞侵袭力较U87组明显减弱,在时间窗96 h,侵袭细胞甚至失去正常形态,细胞呈稀疏、分散分布,并出现胞核固缩、浓染、碎裂等近似于细胞凋亡的征象。本研究首次证明:下调YKL-40基因表达可抑制脑胶质瘤细胞的体外增殖和侵袭能力,推测该抑制作用与G0/G1期阻滞相关。3. YKL-40 SiRNA对人脑胶质瘤细胞体外生物学功能影响机制的探讨采用Western blot凝胶蛋白电泳法测定脑胶质瘤细胞中MAPK信号通路家族各主要成员,其活性磷酸化蛋白和总蛋白( Phospho-ERK1/2, ERK1/2;Phospho-p38, p38;Phospho-JNK1/2,JNK1/2 )的表达及AKT蛋白活性形式( Phospho-AKT,p-AKT )的表达;并进一步通过Gel shift法探索核转录因子NF-κB ( Nuclear factor kappa B, NF-κB )与AP-1 ( Activator protein-1,AP-1 )参与调控胶质瘤细胞体外增殖和侵袭的可能性。研究发现,胶质瘤细胞瞬转YKL-40 SiRNA后,与细胞增殖过程密切相关的MAPKs家族成员p-ERK1/2和细胞周期调控密切相关的p-AKT的表达显著降低( P < 0.01 );与此同时,MAPKs家族中与细胞凋亡关系紧密的成员p-p38和p-JNK1/2表达显著升高( P < 0.01 )。提示:YKL-40基因沉默诱导的脑胶质瘤U87细胞增殖受抑可能主要是通过下调ERK1/2和AKT信号通路的表达而实现的;p-p38和p-JNK表达的上调则表明肿瘤细胞凋亡活跃。而Gel shift法结果则显示,在YKL-40 SiRNA瞬转后的细胞核蛋白中,核转录因子NF-κB与AP-1的表达量无明显改变。我们认为这可能是由于YKL-40启动子上存在可与其它种类核转录因子更紧密结合位点的缘故。本研究首次证实了MAPKs及PI3K / AKT信号传导通路参与了YKL-40基因沉默引起的胶质瘤细胞增殖受抑现象,并间接地反映了YKL-40在脑胶质细胞瘤的生长过程中可能发挥的促进增殖与凋亡回避作用。4.人重组INF-α和白藜芦醇下调YKL-40表达的干预性研究以荧光素酶报道基因质粒PGV-B2为模板,成功构建YKL-40启动子,并将其转染入脑胶质瘤U87细胞,进一步探讨几种临床常用的化疗药物对YKL-40启动子活性的影响。这些药物包括:TNF-α( Tumor necrosis factor-α, TNF-α, 10 ng/ml )、MIP-1 ( Macrophage inflammatory protein-1, MIP-1, 10 ng/ml )、INF-α( 2000 u/ml )和一种具有抗癌作用的植物提取物白藜芦醇( Resveratrol,Res ) ( 100μM )。初步的启动子活性测定结果显示, TNF-α、MIP-1、INF-α和Res均可降低YKL-40启动子的活性,但又以INF-α和Res的作用最为显著( P < 0.01 )。进而通过实时定量RT-PCR法检测INF-α和Res对YKL-40 mRNA转录水平的影响。结果表明,经2000 u/ml INF-α作用24 h、48 h和72 h后, YKL-40 mRNA的转录水平均降低,其中尤以时间窗48 h和72 h更明显,其统计学意义最为显著( P < 0.01 ) ;经100μM Res作用24 h,48 h和72 h后,YKL-40 mRNA的转录水平明显下降,且各时间窗的统计学意义均非常显著( P < 0.01 )。在YKL-40蛋白表达水平方面,半定量Western blot法和定量ELISA法分别证明, 2000 u/ml INF-α作用24 h,48 h和72 h后,YKL-40蛋白及分泌蛋白表达量降低,尤以48 h和72 h统计学差异最为显著( P < 0.01 )。而经100μM Res作用24 h,48 h和72 h, YKL-40蛋白及分泌蛋白表达量亦显著下降。与实时定量RT-PCR结果相吻合的是,各时间窗的统计学意义均非常显著( P < 0.01 )。进一步的WST-1法与Matrigel体外侵袭实验结果提示:100μM Res可显著抑制U87细胞的体外增殖与侵袭能力。Western blot凝胶蛋白电泳法结果显示:ERK1/2信号通路参与了Res对U87细胞增殖的抑制作用;Res可降低U87细胞中p-ERK1/2的表达,并与时间呈正相关关系。本研究首次证实了INF-α和Res可显著下调胶质瘤细胞中YKL-40的表达与分泌,其作用尤以Res更为突出。5.白藜芦醇抑制脑胶质瘤细胞生长与诱导细胞凋亡的实验研究通过MTT法观测到Res对C6细胞具有生长抑制作用,其中在90μM - 210μM的浓度范围时,其抑制作用最为明显;采用FCM检测细胞周期结果证实,210μM Res作用24 h后,C6细胞周期明显滞于S期。RT-PCR法及Western blot凝胶电泳法分别检测不同浓度Res作用24 h和48 h后,细胞中Caspase 3 mRNA转录水平及蛋白的表达显示,Caspase 3 mRNA的转录水平、蛋白的活性形式及总蛋白的表达与Res作用的浓度和时间呈正相关关系。这证明了Res可抑制C6细胞的增殖并滞细胞周期于S期,同时,可通过激活Caspase 3从而诱导C6细胞发生凋亡。此外,其对正常3T3细胞的增殖无抑制作用,亦无凋亡诱导作用。基于上述实验结果,我们认为,YKL-40在脑胶质细胞瘤的发生、发展与演进过程中扮演了重要角色;以下调其表达为靶向的辅助性治疗具有良好的临床应用前景,这有望成为脑胶质细胞瘤综合治疗中的一个新领域。