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背景和目的非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）可进展为肝纤维化,最终导致肝硬化和肝癌。其进展机制尚不明确,但已有证据表明肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSCs）活化在肝纤维化中具有关键作用。在NAFLD时HSCs可能和正常肝细胞一样暴露于来自循环脂质的高浓度游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）中。然而,高脂微环境在激活HSCs中的作用尚不清楚。研究表明,Rho/ROCK信号通路通在HSCs的活化增值、迁移等方面具有重要的调控作用。本研究旨在探讨高脂微环境对HSCs的影响及对Rho/ROCK信号通路的调节作用。方法1.取成年雄性SD大鼠（体重300.0 g-400.0 g）,用Percoll密度梯度离心法分离大鼠原代HSCs,加入完全培养基培养;328nm紫外光及倒置相差显微镜观察原代HSCs自发荧光和细胞形态;使用台盼蓝染色法检测细胞活力;油红O染色观察原代HSCs核周脂滴着色;免疫细胞化学染色（immunocytochemistry,ICC）检测Desmin与α-SMA的表达,最终鉴定原代HSCs。2.雄性SD大鼠（体重350.0 g-400.0 g）,禁食48 h（8:00 am-8:00 am）,再饲喂高脂饲料（high fat die,能量5.58 kcal/g）,于0 h、2 h、3 h、4h采集门静脉血液,分离获得饥饿再饲喂（re-feeding）大鼠门静脉高脂血清;将棕榈酸（palmitic acid,PA）粉末加入配制的10%牛血清白蛋白（BSA,bovine serum albumin）溶液中,于50°C搅拌24h使其充分溶解,配制成8m M的PA溶液。分别使用PA溶液和门静脉高脂血清构建体外高脂微环境模型,不同浓度的PA溶液（0、100、200、300、500、1000μmol/L）和不同浓度高脂血清（低、中、高浓度）分别培养大鼠原代HSCs和人肝星状细胞系（LX-2）。流式细胞术和CCK法检测细胞增殖,Western Blotting和实时荧光定量PCR（real time PCR）检测细胞中PDGF、TGF-β、α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ的蛋白和mRNA表达水平;细胞划痕实验检测HSCs的迁移能力变化。3.Real time PCR检测Rho和ROCK mRNA表达水平,研究高脂微环境对HSCs增殖活化及迁移的作用机制。结果1.用Percoll密度梯度离心法分离大鼠原代HSCs,台盼蓝拒染率>95%,在328 nm紫外光下可观察到自发荧光;倒置相差显微镜可以观察到典型的肝星状细胞形态变化:由透亮的小圆形细胞逐渐增大呈多边形、小星芒状,最后细胞融合成片,胞体宽大,胞浆轴突完全伸展,细胞骨架明显;油红O染色可见原代HSCs核周脂滴着色;ICC显示静止的原代HSCs中Desmin（+）、α-SMA（-）,活化的原代HSCs中Desmin（+）、α-SMA（+）。2.与正常对照大鼠门静脉血清中TG（0.87±0.18 mmol/L）和FFA（0.77±0.05mmol/L）相比,饥饿再饲喂大鼠2h、3h、4h门静脉血清中TG的含量分别为1.64±0.28、2.48±0.23、3.12±0.18 mmol/L（P<0.05）,FFA的含量分别为0.91±0.03、1.50±0.11、1.79±0.28 mmol/L（P<0.05）。将LX-2细胞暴露于不同浓度的PA和大鼠门静脉高脂血清均显著促进细胞中脂质的蓄积,且呈剂量依赖性（P<0.05）,表明成功建立了体外高脂微环境细胞学模型。3.PA与门静脉高脂血清对HSCs产生不同的效应。（1）使用不同浓度的PA和高脂血清分别处理LX-2细胞和原代HSCs,PA抑制LX-2细胞的增殖,而高脂血清却促进LX-2增殖,且呈时间、剂量反应关系。（2）较高浓度的PA使LX-2细胞中α-SMA表达上调,Ⅰ、Ⅲ型胶原表达降低,低浓度的PA（100μM）促进Ⅲ型胶原的表达;Real time PCR及Western Blotting结果显示,高脂血清促进LX-2细胞α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达。（3）各浓度的PA作用大鼠原代HSCs 12h后,细胞中的α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA表达水平均出现了不同程度的升高,而高脂血清处理后仅有高浓度高脂血清组促进α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原表达升高;（4）划痕实验发现较高浓度的PA和高脂血清都能促进LX-2细胞迁移。4.1000μM的PA促进LX-2细胞中TGF-β和PDGF mRNA的表达,高浓度高脂血清组促进LX-2细胞中PDGF mRNA的表达,但抑制TGF-βmRNA的表达;所有浓度的PA和高浓度高脂血清组均促进了原代HSCs中TGF-β和PDGF mRNA的表达;1000μM的PA和高浓度高脂血清组促进了LX-2细胞中Rho和ROCK mRNA的表达,且与TGF-β和PDGF的表达基本一致。结论1.采用肝脏原位灌注、离体消化及Percoll密度梯度离心法成功分离大鼠原代HSCs,并鉴定了静止与活化状态的HSCs。2.成功建立了高脂微环境模型,模拟了不同高脂条件下细胞的培养,发现PA能够导致LX-2细胞内脂质积累,高脂微环境可促进HSCs中α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ的表达,从而影响HSCs的活化、增殖及迁移。3.高脂微环境可能通过调节HSCs中TGF-β和PDGF的分泌来上调Rho/ROCK信号通路的表达,促进HSCs活化,导致肝纤维化的发展。