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目的:IFN-α作为治疗慢性乙型肝炎的主要抗病毒药物之一,其抗病毒效果受到多种宿主或病毒因素影响。临床研究发现,慢性乙型肝炎患者外周血及肝脏内炎性细胞因子IL-17A的水平显著升高;且PEG-IFN-α治疗后,应答者血清IL-17A水平较应答不佳者下降更为显著。我们课题组前期体外实验发现,IL-17A预处理可拮抗IFN-α抗HBV效应。因此,本课题将进一步探讨IL-17A调节IFN-α抗HBV作用的潜在机制。方法:1.在GEO数据库中获得一个公共数据集GSE89610,其包含了IL-17A处理Huh7.5细胞(肝癌细胞系)24 h的的转录组数据。用GEO2R平台统计分析IL-17A处理组和空白对照组之间相对基因表达量的差异,根据p值筛选差异表达基因(DEGs)(设定阈值为p<0.05)。这些DEGs一方面通过基因集富集分析(GSEA)观察I型干扰素通路的变化;另一方面与Interferome数据库进行比对,观察与I型干扰素调节相关靶基因的变化。从总体上了解IL-17A对肝细胞内I型干扰素通路的影响。2.以转染pc DNA3.1-HBV1.3质粒的HepG2(HepG2-HBV1.3)为细胞模型,用50ng/ml IL-17A预处理HepG2-HBV1.3细胞24h,再用1000 IU/mL IFN-α作用24h或48h。提取细胞总RNA,用q-PCR法检测IFNAR1 mRNA的水平;提取细胞总蛋白,用western blot法检测IFNAR1蛋白的水平。分析IL-17A对IFNAR1表达的影响;3.用50ng/ml IL-17A预处理HepG2-HBV1.3细胞24h,再用1000IU/mL IFN-α作用30min,6h或24h。提取细胞总蛋白,用western blot法检测细胞内磷酸化蛋白p-TYK2和p-JAK1的水平。分析IL-17A是否影响IFNAR1下游信号衔接子的磷酸化激活;4.用50ng/mL的IL-17A预处理HepG2-HBV1.3细胞24h,再用1000 IU/mL IFN-α处理24h。提取细胞总蛋白,用western blot法检测细胞内转录因子复合物ISGF3(p-STAT1/p-STAT2/IRF9)的蛋白水平,同时检测总STAT1(T-STAT1)及总STAT2(T-STAT2)蛋白水平。分析IL-17A预处理是否影响IFN-α信号通路中转录因子复合物ISGF3的表达和活化;5.用50ng/ml IL-17A预处理HepG2-HBV1.3细胞24h,再用1000IU/mL IFN-α作用24h。提取细胞总RNA,用q-PCR法检测细胞内抗病毒相关干扰素刺激基因(ISGs)(ISG15、ISG20、Mx A及OAS)以及IFN-α信号通路负调节性干扰素刺激基因(SOCS1、SOCS3及USP18)的mRNA表达水平。分析IL-17A预处理是否影响抗病毒相关ISGs和IFN-α信号通路负调节性ISGs的表达;6.用5uM or 20uM C25-140预孵育HepG2-HBV1.3细胞6h后50ng/ml IL-17A预处理24h,再用1000 IU/mL IFN-α作用24h。用ELISA法检测细胞培养上清液中HBs Ag及HBe Ag的表达水平;western blot法检测细胞内T-STAT1、p-STAT1、T-STAT2、p-STAT2及IRF9的蛋白水平;用q-PCR法检测细胞内干扰素刺激基因ISG15及Mx A的mRNA表达水平。分析IL-17A信号转导阻断是否可以回复IFN-α的抗HBV效应;7.数据用平均数±标准差(X±SD)表示,用SPSS20.0软件和Graphpad6.1软件进行统计分析,两组之间使用未配对的t检验进行比较,P<0.05为差异具有统计学意义。所有实验进行至少3次。结果:1.IL-17A可显著下调肝癌细胞中I型干扰素通路相关基因的表达:根据设定条件,得到8301个差异表达基因。经GSEA功能富集分析发现IL-17A显着抑制了细胞对I型干扰素的应答途径,其归一化富集分数NES为-1.89,差异有统计学意义(p<0.05,FDR<25%)。通过比对Interferome数据库,从DEGs中筛选出648个I型干扰素调节的靶基因,其中有40个基因据报道与HBV感染或抗HBV反应有关,通过聚类分析发现所有这40个基因的表达均被IL-17A下调。2.IL-17A预处理可显著降低IFN-α作用下的IFNAR1 mRNA及蛋白水平:与空白对照组相比,IFN-α单独处理24h或48h时,IFNAR1的mRNA表达水平显著升高,但IFNAR1的蛋白水平显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与IFN-α单独处理组相比,IL-17A预处理组的IFNAR1的mRNA表达水平和蛋白水平均显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。3.IL-17A预处理未显著影响IFN-α作用下的p-JAK1和p-TYK2水平:与IFN-α单独处理组相比,IL-17A预处理组的细胞内JAK1的蛋白磷酸化水平(p-JAK1)、TYK2的蛋白磷酸化水平(p-TYK2)没有发生显著变化,差异无统计学意义(P>0.05)。4.IL-17A预处理可显著下调IFN-α诱导的ISGF3的水平:与IFN-α单独处理组相比,IL-17A预处理组的细胞内ISGF3的表达,即STAT1和STAT2蛋白磷酸化水平(p-STAT1、p-STAT2)及IRF9蛋白的表达水平,均显著下调。5.IL-17A预处理可显著下调IFN-α诱导的抗病毒相关ISGs表达,而升高负调节性ISGs的表达:与IFN-α单独处理组相比,IL-17A预处理组的细胞内抗病毒相关靶基因ISG15、ISG20及Mx A mRNA的表达水平显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);而细胞内负调节靶基因SOCS1、SOCS3及USP18 mRNA的水平显著升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。6.IL-17A信号转导阻断可以回复IFN-α的抗HBV效应:与IL-17A预处理组相比,20uM C25-140预孵育组的细胞培养上清中HBs Ag及HBe Ag水平显著降低;而5uM或20uM C25-140预孵育组的细胞内STAT1和STAT2蛋白磷酸化水平(p-STAT1、p-STAT2)及IRF9蛋白的表达水平,以及细胞内ISG15和Mx A mRNA的表达水平均显著升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.较高浓度IL-17A预处理24h可显著抑制IFN-α抗HBV效应;2.IL-17A抑制IFN-α抗HBV效应的机制可能包括:抑制ISGF3的表达,增强IFNAR1的降解以及促进SOCS1,SOCS3和USP18的表达。