[研究背景及目的]肝纤维化(hepatic fibrosis)是肝脏对慢性损伤的一种修复反应,以肌成纤维细胞(MFs)大量生成,细胞外基质在肝内过多沉积为特征,导致组织疤痕形成及肝实质正常结构破坏。既往认为,肝星状细胞(HSCs)是肌成纤维细胞的最主要来源。晚近研究表明MFs有多种来源,尤其是胆管细胞和肝细胞已被证明可通过上皮细胞间质转型(EMT)向MFs转化。细胞外信号调节激酶1(ERK1)是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导通路的重要激酶之一。未激活的ERK1/2多数位于胞浆,活化后入核,调控细胞增殖、分化和凋亡等生物学行为。ERK参与转化生长因子β-1 (TGF-β1)或醛固酮诱导的近端小管细胞EMT及肾纤维化。在肝脏,ERK1/2通路介导血小板衍化生长因子-D(PDGF-D)及瘦素等激活MFs。活化的ERK1/2可调控JunD,使金属基质蛋白酶组织抑制剂-1 (TIMP-1)表达增加,胶原降解减少。我们前期基因芯片研究结果表明,随着肝纤维化进展,ERK1表达显著上调。用针对ERK1的小干扰RNA (siRNA)转染活化的HSC,可明显抑制其增殖,诱导其凋亡,并减少胶原合成。总之,以上研究表明,ERK1参与肝纤维化进程,选择性抑制ERK1可能成为肝纤维化治疗的新靶点。本课题旨在探讨ERK1 siRNA对肝纤维化的作用及其机制。研究结果表明腺病毒介导的siRNA可显著抑制ERK1表达,体内导入AdshERKl可缓解胆总管结扎(BDL)或二甲基亚硝胺(DMN)诱导的大鼠肝纤维化,其机制可能是通过抑制HSC增殖、活化,同时逆转胆管上皮细胞或肝细胞EMT。[实验方法]一、重组复制缺陷型腺病毒AdshERKl构建及鉴定化学合成ERK1 shRNA正向链和反向链,退火磷酸化,装入pSuper,再将目的基因连同H1启动子酶切,与无启动子的pShuttle连接获得穿梭质粒pShuttle-H1-shERKl,与pAdEasy-1质粒同源重组后筛选获得pAdshERK1,测序鉴定目的基因序列的正确性。将线性化的pAdshERK1转染293细胞包装,获得AdshERK1。以同样方法构建对照病毒AdshNC。将AdshERK1体外感染活化的肝星状细胞株HSC-T6,以RT-PCR、Western blot和免疫细胞荧光法检测ERK1在HSC-T6中的表达。二、ERK1 siRNA抑制HSC-T6生物学特性的体外研究将病毒感染HSC-T6, MTT法测定其增殖曲线,Real-time RT-PCR、Western-blot及免疫细胞荧光法检测ERK1表达,同时测定Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TIMP-1及TGF-β1等肝纤维化相关基因的mRNA量。三、ERK1 siRNA抑制肝纤维化的体内研究(一)AdshERK1对BDL大鼠肝纤维化的抑制作用将雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠随机分为4组,每组8只,分设假手术组、Model组、AdshNC组和AdshERK1预防组。制备BDL肝纤维化模型。术前2d AdshNC组和AdshERK1组分别经尾静脉导入2×109空斑形成单位／只(pfu/只)AdshNC或2×109 pfu/只AdshERK1。另设治疗模型,病毒导入时间改为术后3d,其余同预防模型。术后3w处死大鼠,Real time RT-PCR及免疫组织化学法测定肝组织ERK1及Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-平滑肌激动蛋白(α-SMA)表达；碱水解法测定各组肝组织羟脯氨酸含量；HE、Masson和Sirius red染色测定ECM含量并对肝纤维化程度分级,图象分析仪半定量分析。(二)AdshERK1对DMN损伤大鼠肝纤维化的抑制作用将雄性SD大鼠随机分为4组,每组8只,第1组为正常对照组,2-4组予1%DMN按100μ1/100g体重腹腔注射,每周连续注射3次,共4w。其中第2组设为Model组,第3组为AdshNC导入组,第4组为AdshERK1导入组。于第6次注射DMN后,AdshERK1组和AdshNC组分别经尾静脉导入2×109 pfu/只AdshERK1或2×109p增、只AdshNC,注射病毒2w后处死大鼠,观察指标同BDL模型。四、下调ERK1表达对肌成纤维细胞、肝星状细胞及EMT的作用免疫组化双标法检测ERK1与MFs标志α-SMA表达位置的关系。连续切片免疫组化法测定α-SMA与HSC标志物结蛋白(desmin)、神经胶质酸性蛋白(GFAP)。显微镜下随机选取多个相同区域对比两种细胞的位置及数量,以明确ERK1表达与HSC的关系及HSC在MFs形成过程中的作用。免疫组化双标法检测BDL模型各组肝组织中胆管上皮细胞标志物细胞角蛋白19(CK19)与α-SMA的表达位置关系。免疫荧光双标法检测DMN模型各组肝组织中肝细胞标志物白蛋白与α-SMA的位置关系。免疫组化法检测上皮细胞标志物上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)及间质细胞标志物波形蛋白(Vimentin)和Snail表达。免疫组化法检测肝组织中增殖细胞核抗原(PCNA)表达。五、统计学处理数据采用SPSS 11.0统计软件包进行分析,结果以X±SD表示。多组间采用One-Way ANOVA分析,方差非齐性则采用非参数检验；P<0.05为具有显著性差异,P<0.01为具有非常显著性差异。[实验结果]一、AdshERK1构建及鉴定经293细胞包装获得2×1010 pfu/ml滴度的AdshERK1; AdshERK1体外感染HSC-T6 72h和96h后,real time RT-PCR、Western blot和免疫荧光显示ERK1在转录和翻译水平上的表达均明显减弱,证实病毒构建成功并能在细胞内抑制ERK1表达。二、AdshERK1对HSC-T6生物学特性影响(一)将AdshNC及AdshERK1以MOI 1200感染HSC-T6, MTT法连续测定其后5d生长曲线。结果显示,病毒感染后前2天,AdshNC及AdshERK1均可抑制HSC-T6增殖,程度无明显差别；从3天开始,与NC组相比,AdshERK1组细胞增殖明显减慢,至第5天Ad shERKl组的吸光度值降至AdshNC的50%(P<0.001)。(二)Real-time RT-PCR显示,AdshERK1可明显下调HSC-T6肝纤维化相关基因表达：Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TIMP-1和TGF-β1分别下调44%(P<0.01)、57%(P<0.01)、35%(P<0.05)和47%(P<0.05)。三、AdshERK1对大鼠实验性肝纤维化的抑制作用(一)AdshERK1对大鼠BDL肝纤维化的预防作用：AdshERK1预防组肝组织羟脯氨酸含量为199.84±4.20μg/g,较模型对照组(288.28±11.46μg/g,P<0.05)和AdshNC组(272.59±7.8μg/g,P<0.05)明显减少。AdshERK1预防组胶原染色面积较AdshNC组减少62%(P<0.01)。免疫组化结果显示Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及α-SMA表达较AdshNC组均显著下降。(二)AdshERK1对大鼠BDL肝纤维化的治疗作用：AdshERK1治疗组肝组织羟脯氨酸(230.12±24.35μg/g)较模型对照组(383.52±12.04μg/g, P<0.05)和AdshNC组(392.05±19.69μg/g, P<0.01)明显减少。与AdshNC组相比,AdshERK1治疗组胶原染色面积较减少64%(P<0.05)。(三)AdshERK1对DMN肝纤维化的治疗作用：DMN模型对照组和AdshNC组肝组织强脯氨酸含量分别为359.41±59.10μg/g和355.11±54.82μg/g, AdshERK1治疗组羟脯氨酸含量为198.94±26.33μg/g,较上述两个对照组均明显减少(P<0.05)。AdshERK1组胶原染色面积较AdshNC组减少74%(P<0.01)。三、ERK1与肌成纤维细胞活化相关ERK1与α-SMA免疫双标显示,在BDL纤维化肝脏,ERK1主要分布在新生的胆管上皮细胞胞浆和胆管周围的某些细胞核内,后者大部分同时表达α-SMA,表明其为活化的MFs。同样,在DMN纤维化肝脏,ERK1和α-SMA双阳性的肌成纤维细胞也明显增加。AdshERKl可显著减少这些细胞的量。四、胆管上皮细胞和肝细胞可转化为肌成纤维细胞(一)我们用连续切片法分别检测了α-SMA、HSC标志物desmin和GFAP在正常肝脏、纤维化肝脏及AdshERK1治疗后肝脏的表达情况。结果发现,BDL或DMN处理后均可导致肝脏α-SMA表达增加,而desmin或GFAP所标识的HSC,只占这些MFs的50%左右。这表明MFs并不是完全来自HSC。(二)为研究MFs的其他来源,我们将α-SMA分别与CKl9进行免疫双标检测。结果显示,在BDL肝纤维化模型,除新生的胆管细胞为CK19阳性外,在胆管周围及纤维束内,也检测到一些CK19弱阳性的细胞,有趣的是,这些微量表达CK19的细胞同时也表达α-SMA,而AdshERK1可明显减少这类细胞。以上结果表明胆管上皮细胞可转化为MFs。(三)在DMN模型,α-SMA与白蛋白免疫双标结果发现,除肝细胞外,在纤维间隔内也有到一些白蛋白弱阳性的细胞,同时表达α-SMA,表明肝细胞可转变为MFs。AdshERKl也可明显减少这类细胞。五、AdshERK1可阻断EMT免疫组化法显示,BDL和DMN诱导的肝纤维化模型中,肝组织E-cadherin表达均明显减少,vimentin和snail上调。AdshERKl导入可逆转上述变化,同时,TGF-β在AdshERK1治疗组也明显减少。DMN诱导的纤维化肝脏中,PDGF-BB、骨形态发生蛋白(BMP4)和p-Smadl随ERK1表达增加而上调,AdshERK1治疗减少上述蛋白的表达。PCNA免疫组化显示,纤维化肝脏肝细胞增殖明显受抑,AdshERK1治疗后,增殖的肝细胞增多,表明AdshERK1并不抑制肝细胞增殖。[结论]一、ERK1 siRNA可抑制活化肝星状细胞HSC-T6 ERK1表达,减慢其增殖并下调肝纤维化相关基因表达。二、ERK1 siRNA可明显抑制BDL和DMN肝纤维化大鼠肝脏ECM沉积,是治疗实验性肝纤维化新的有效方法。三、纤维化过程中活化的肌成纤维细胞不仅来自于肝星状细胞,也来自于胆管上皮细胞或肝细胞EMT。四、ERK1表达与肌成纤维细胞活化有关,ERK1 siRNA可抑制肌成纤维细胞活化。五、ERK1 siRNA治疗肝纤维化的主要机制是抑制肝星状细胞活化和逆转胆管上皮细胞肝细胞EMT。