一种理想的组织工程人工神经应该是由种子细胞、生物材料、细胞外基质以及诱导和促进神经生长的因子等几部分构成的有机统一体。在课题组前期的工作中我们已经先后通过探讨了组织工程人工神经的种子细胞—雪旺细胞培养方法,获得了较大数量、较高纯度的雪旺细胞。通过改良去细胞同种异体神经桥接体的制备方法,获得了较为理想的人工神经天然支架。随后的雪旺细胞与去细胞同种异体神经桥接体的体外组织相容性研究也证实：采用胎兔坐骨神经培养的雪旺细胞能在用成年兔坐骨神经制备的去细胞桥神经接体中生长良好,并且具有迁移成行的特性。在前期研究基础上本课题将尝试将血管内皮细胞与雪旺细胞联合培养移植以促进组织工程人工神经血管化,进一步探讨组织工程人工神经再血管化策略。为此,本课题拟从以下三个方面开展研究：(1)将胎兔雪旺细胞复合体桥接修复兔坐骨神经缺损的动物实验研究,明确胎兔雪旺细胞神经复合体修复周围神经缺损可行性；(2)体外雪旺细胞与血管内皮细胞共培养的实验研究,探讨将雪旺细胞和血管内皮细胞联合培养的最适比例；(3)将血管内皮细胞与组织工程人工神经中的种子细胞-雪旺细胞联合种植至预先制备好的去细胞同种异体神经段中,尝试先在体外对神经移植体行预血管化,并用这种预血管化的人工神经重建成年兔坐骨神经的功能。观察比较预血管化处理和不进行预血管化处理两种移植复合体对神经功能恢复的影响。通过上述三个方面的研究,探讨早期预血管化移植体对神经功能恢复的影响。第一部分种植胎兔雪旺细胞重新细胞化的脱细胞异体神经修复神经缺损的动物实验目的：利用胎兔坐骨神经培养雪旺细胞,然后将其在体外与经化学去细胞处理的同种异体神经段形成重新细胞化的神经桥接复合体,并用于修复成年兔坐骨神经缺损,探讨种植雪旺细胞的去细胞神经桥接复合体修复周围神经缺损的可行性。方法：实验包括胎兔雪旺细胞培养、去细胞神经桥接体的制备以及去细胞神经桥接体复合体的动物实验三个部分。使用双酶消化法培养雪旺细胞并将其种植于经3%TritonX-100作用96h后的同种异体神经中。实验组：将胎兔雪旺细胞神经复合体桥接用于移植修复成年兔坐骨神经缺损。对照组：单纯应用未重新细胞化的去细胞同种异体神经段移植修复成年兔坐骨神经缺损。分别观察两组坐骨神经的再生及功能恢复情况,观察兔的足部溃疡形成及愈合情况。于4周,8周,12周行肌电图检查,在光镜下观察神经轴突的再生情况,并进行统计学分析。结果：实验组和对照组两组动物分别在术后第4周、第8周和第12司时观察,非常明显的排斥反应均未在手术操作的局部区域或全身出现。实验组足部溃疡愈合情况、再生神经纤维数目与对照组相比有显著差异(对照组差于实验组)。神经传导速度(NCV)的比较：①在术后第4周时,实验组和对照组均未出现特别明显的神经传导；②在术后第8周时,神经传导速度实验组为24.80±1.27 m/s,对照组为18.72±0.81 m/s,T值-10.91,P<0.05；③在术后第8周时,神经传导速度实验组为37.95±2.43m/s,对照组为32.58±1.89 m/s,T值-5.01,P<0.05。两组有显著差异性。神经纤维数目的比较：①在术后第4周时实验为750.65±74.24根,对照组为543.67±61.42根,T值-5.30,P<0.05；②在术后第8周时,实验组为2067.83±231.65根,对照组为1804.50±156.65根,T值-2.29,P<0.05；③在术后第12周时,实验组为34340.33±124.48根,对照组为2495.17±154.95限,T值-11.25,P<0.05。两组比较有显著差异性。结论：胎兔雪旺细胞能在经去细胞处理的同种异体神经中生长并发挥生物活性,种植胎兔雪旺细胞重新细胞化后的同种异体神经不仅可以为新生轴突生长提供具有良好空间结构的支架,而且与单纯化学去细胞处理的异体神经相比,重新细胞化后的同种异体神经在诱导和促进新生神经轴突再生等方面更具优势。第二部分胎兔血管内皮细胞与胎兔雪旺细胞在体外共同培养体系的建立目的：在体外将雪旺细胞和血管内皮细胞联合培养,建立最适比例的胎兔血管内皮细胞与胎兔雪旺细胞在体外共同培养体系,为进一步探讨组织工程人工神经再血管化策略提供实验依据。方法：取胎兔坐骨神经以及胸主动脉采用酶消化法分别进行单独培养胎兔SCs和VECs,随后将培养好的胎兔SCs和VECs移入含20%胎牛血清的DMEM/F12及M199的混合培养基中,根据移入的SCs和VECs细胞数量比例分别设为实验组的A组(1：1)、B组(2：1)、C(4：1)三组,各组DMEM/F12及M199培养基的比例根据细胞比例也作相应调整。与此同时,将相同数量的SCs继续进行单独培养并设为对照组D。各组分别在细胞培养后的第1、3、5、7天,对SCs进行计数并根据计数情况绘制SCs的生长曲线。结果：1随着细胞培养时间的增加,各组SCs的数量也不断增加,SCs和VECs能够在同一细胞培养孔中各自生长。2在细胞共同培养第1天,A、B、C三个实验组与对照组D中的SCs细胞数量无显著性差异(P>0.05),在细胞共同培养的第3天、第5天、第7天,A组和C组SCs计数与对照组D相比有统计学差异(P<0.05),D组的SCs数量高于A、C两组；B实验组的SCs数量与对照组D相比则无明显统计学差异(P>0.05),实验组B与实验组A、C则有显著差异(P<0.05),B组SCs数量高于A、C两组。结论：利用胎兔坐骨神经培养的SCs能够在体外与利用胸主动脉培养的VECs进行共同培养；在胎兔血管内皮细胞与胎兔雪旺细胞体外共同培养的体系中,当VECs与SCs的比例为1：2时,SCs的生长能力及活性维持最好。第二部分胎兔血管内皮细胞与胎兔雪旺细胞在体外共同培养体系的建立目的：在体外将雪旺细胞和血管内皮细胞联合培养,建立最适比例的胎兔血管内皮细胞与胎兔雪旺细胞在体外共同培养体系,为进一步探讨组织工程人工神经再血管化策略提供实验依据。方法：取胎兔坐骨神经以及胸主动脉采用酶消化法分别进行单独培养胎兔SCs和VECs,随后将培养好的胎兔SCs和VECs移入含20%胎牛血清的DMEM/F12及M199的混合培养基中,根据移入的SCs和VECs细胞数量比例分别设为实验组的A组(1：1)、B组(2：1)、C(4：1)三组,各组DMEM/F12及M199培养基的比例根据细胞比例也作相应调整。与此同时,将相同数量的SCs继续进行单独培养并设为对照组D。各组分别在细胞培养后的第1、3、5、7天,对SCs进行计数并根据计数情况绘制SCs的生长曲线。结果：1随着细胞培养时间的增加,各组SCs的数量也不断增加,SCs和VECs能够在同一细胞培养孔中各自生长。2在细胞共同培养第1天,A、B、C三个实验组与对照组D中的SCs细胞数量无显著性差异(P>0.05),在细胞共同培养的第3天、第5天、第7天,A组和C组SCs计数与对照组D相比有统计学差异(P<0.05),D组的SCs数量高于A、C两组；B实验组的SCs数量与对照组D相比则无明显统计学差异(P>0.05),实验组B与实验组A、C则有显著差异(P<0.05),B组SCs数量高于A、C两组。结论：利用胎兔坐骨神经培养的SCs能够在体外与利用胸主动脉培养的VECs进行共同培养；在胎兔血管内皮细胞与胎兔雪旺细胞体外共同培养的体系中,当VECs与SCs的比例为1：2时,SCs的生长能力及活性维持最好。第三部分血管化同种异体神经复合体桥接修复兔坐骨神经缺损的实验研究目的：探讨将经化学去细胞处理的同种异体神经复合体预血管化处理后移植修复兔长段坐骨神经缺损的可行性以及早期血管化移植体对神经功能恢复的影响。方法：将雪旺细胞与血管内皮细胞在体外联合培养成功后将其种植于预先制备的经脱细胞处理完善的同种异体神经段中,制备成预血管化的人工神经并将其用于修复兔缺坐骨神经缺损(实验组),对照组移植体中单纯种植雪旺细胞,无血管内皮细胞。术后4周,8周,16周对两组动物行肌电图检查,观察神经功能恢复情况,然后,手术取材,应用光镜、电镜观察坐骨神经再生和髓鞘形成情况,应用图像分析系统对髓鞘厚度以及有髓神经纤维轴突的直径、数目进行量化分析。结果：1大体观察,术后4周、8周、16周两组动物全身及局部均未出现明显的排斥反应。足部溃疡恢复情况以及步态恢复情况实验组均优于对照组;2术后8周实验组神经传导速度为23.35±1.05m/s,对照组为23.11±0.80m/s,T值2.13,P<0.05。术后16周实验组神经传导速度为39.52±1.0 m/s,对照组为38.34±0.15 m/s,T值2.15,P<0.05。3胫前肌湿重测量：4周时两组动物胫前肌湿重(实验组2.22±0.13g,对照组2.20±0.16g)组间无显著差异(P>0.05)。8周时实验组3.38±0.11 g,对照组3.28±0.07g,T值2.89,P<0.05,组间有显著差异。术后12周实验组6.10±0.22g,对照组5.97±0.15g,T值2.14,P<0.05,组间有显著差异。4再生神经纤维的数量：4周时实验组为922.97±25.06,对照组为901.48±12.39,T值3.26,P<0.05,组间有显著差异。8周时实验组为1736.44±36.28,对照组为1713.51±25.00,T值2.20,P<0.05,组间有显著差异。12周时实验组为2840.91±20.93,对照组为2823.74±14.42,T值2.86,P<0.05,组间有显著差异。5有髓神经纤维轴突直径：4周时实验组为5.83±0.16μm,对照组为5.58±0.42μm,T值2.27,P<0.05,组间有显著差异。8周时实验组为6.01±0.09μm,对照组为5.87±0.16μm,T值3.09,P<0.01,组间有显著差异。12周时实验组为6.11±0.08μm,对照组为6.00±0.07μm,T值4.62,P<0.0001,组间有显著差异。6髓鞘厚度：4周时实验组为1.95±0.14μm,对照组为1.70±0.22μm,T值4.10,P<0.05,组间有显著差异。8周时实验组为1.99±0.11μm,对照组为1.85±0.16μm,T值3.10,P<0.01,组间有显著差异。12周时实验组为2.03+0.05μm,对照组为1.90±0.06μm,T值7.16,P<0.0001,组间有显著差异。结论：应用预血管化的组织工程人工神经移植体修复兔坐骨神经缺损能有效地促进受损神经的功能恢复。