传统皂素生产工艺由于采用纯化学法,酸水解黄姜根茎所造成的生产废水具有高酸度、高COD、高硫酸盐等难处理特性,是南水北调中线水源区水质安全的重大隐患。北京大学黄姜皂素“催化-溶剂法”生产工艺研究改进了传统加工工艺,在保证皂苷完全提取的前提下,分离黄姜中大量淀粉和纤维素,从而消减了污染排放量,实现了清洁生产工艺。为了得到皂素,该法所得黄姜皂苷仍不可避免要经过化学酸水解,而天然产物的生物转化法为解决该问题提供了新思路。　　 本文基于北京大学“催化-溶剂法”黄姜粗提皂苷,以工业化应用为导向和出发点,首先建立了黄姜中皂苷成分的定性定量测定方法;其次,筛选商品酶对黄姜混合皂苷进行水解,为生物法生产皂素提供科学依据。研究过程中侧重黄姜皂苷生物转化机理,深入分析酶解混合皂苷的动态过程,并对该酶中的有效组分进行分离纯化和酶学性质研究。最后,对来源于微生物的游离酶水解皂苷特性及其固定化应用进行初步研究,补充了不同来源的生物酶在黄姜皂苷水解中的应用及机理研究。论文取得主要成果如下:　　 (1)本文通过对普通溶剂粗提皂苷和“催化-溶剂法”粗提皂苷的LC-ESI-MSn(n=1～3)分析,与标准品对照以及参考已有文献,定性鉴定黄姜中8种已知皂苷和3种类呋甾皂苷,共11种皂苷和类皂苷物质,分别是原纤细皂苷,Protobioside,盾叶新苷,纤细皂苷,薯蓣皂苷,盾叶皂苷A1,薯蓣皂苷元-双葡萄糖皂苷,延龄草苷,呋甾皂苷A,呋甾皂苷B,呋甾皂苷C。通过5种标准品皂苷,建立了皂苷中8种已知皂苷以及3种皂苷类似结构物质的定量和半定量测定方法,该法精密度、准确性均符合检测要求。“催化-溶剂法”粗提皂苷的成分与实验室醇提皂苷成分相似,其各成分比例与50％和70%醇提皂苷的比例相似。　　 (2)以“催化-溶剂法”粗提皂苷为底物,从属于糖苷水解酶(E.C.3.2.1.X)的商品酶中筛选出能有效将其水解为皂素的来源于Trichoderma viride的商品纤维素酶。经过条件优化后发现温度、pH、酶用量及底物浓度对酶水解产生皂素和还原糖都存在影响。最优条件分别是pH5.0,温度55℃,酶加量为15×103 U/g,底物浓度10 mg/mL。研究表明过量的酶投加和过高的底物浓度对酶催化都有抑制作用。单用该商品纤维素酶解可达到7天产76.09±4.29%皂素的得率;酶解与酸解结合后酸用量减少60%,且皂素提取率比传统酸水解法提高15.4±2.7%。　　 (3)该商品酶水解“催化-溶剂法”黄姜粗提皂苷的水解中间产物主要为具有三糖链的纤细皂苷和具有双糖链的盾叶皂苷A1。该酶对混合皂苷和单体皂苷的机理研究表明,该纤维素酶在水解过程初期首先水解呋甾皂苷C26位上葡萄糖,使其转化为相应的螺甾皂苷,接着依次水解螺甾皂苷C3位末端β-Glu糖链和1,3连接的α-Rha产生次生螺甾皂苷和皂素。该酶还能直接水解原纤细皂苷C3上连接的所有糖链得到皂素。　　 (4)通过DEAE-sepharose CL-6B离子交换、SephMex G75葡聚糖凝胶过滤对该纤维素酶纯化可得到一条电泳纯的蛋白,分子量为57 kDa。该纯化酶最佳pH为5.0,最适温度为60℃;酶活于pH4.0～5.5,温度低于50℃时较稳定。该纯化酶可选择性水解皂苷C26的β-Glu和C3末端的β-Glu糖链,并产生皂素。通过肽指纹图谱分析显示该酶肽段与粟酒裂殖酵母中一个尚未表征的蛋白具有高度相似性,有可能是一种尚未研究的新的水解酶。　　 (5)选用本课题组已筛选出具有高度转化黄姜原料中皂苷为皂素能力的T.reesei,将其进行紫外诱变和底物诱导后得到糖苷酶活性更高的菌株。该菌株水解皂苷的最佳pH、温度分别是pH=4.0和50℃,与商品酶相比,该诱变菌株转化能力稍弱,仅有61%的皂素转化率。对该酶的固定化材料、方法、条件等进行研究的结果表明,固定化载体应用溶剂粗提后的黄姜渣具有经济和高活性的双重优势,固定化方法条件为0.3 g载体加入5 mL酶液,200mM pH=4.0醋酸缓冲溶液的条件下固定化7h。与游离酶相比,固定化T.reesei来源糖苷酶的最适pH和温度不变,但pH稳定范围由4.0～5.0提升到4.O～7.5,且温度稳定性明显增加。动力学实验表明固定化酶与底物亲合性增加。