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目的:观察4月龄、6月龄HIF-1α基因敲除小鼠膝关节软骨退变情况,观察2.5月龄、4.5月龄HIF-1α基因敲除小鼠椎间盘软骨退变情况,并研究中药复方益气化瘀方对HIF-1α基因敲除小鼠退变膝关节及椎间盘软骨的影响,探讨其作用环节和机制。 方法: 1HIF-1α基因敲除小鼠膝关节软骨表型的观察 将杂交繁殖获得HIF-1α+/+小鼠和同窝出生HIF-1α-/-小鼠,分为HIF-1α+/+小鼠4月龄组、HIF-1α-/-小鼠4月龄组、HIF-1α+/+小鼠6月龄组和HIF-1α-/-小鼠6月龄组,每组6只。分别在4、6月龄依次处死相应的小鼠,取膝关节软骨,分别进行Mankin评分、藏红固绿、HE及免疫组化相关指标染色及分析,研究软骨组织的改变情况。 2益气化瘀方对HIF-1α基因敲除小鼠膝关节软骨的影响 将2月龄HIF-1α-/-小鼠随机分为生理盐水组和益气化瘀方组,以生理盐水组小鼠作为正常对照,每组6只,共计12只小鼠。灌胃给药2月后,取各组小鼠的膝关节,分别进行Mankin评分、HE染色和藏红固绿染色,ColⅡ、ColX、VEGF、MMP-13和Sox-9免疫组化染色及分析。 3HIF-1α基因敲除小鼠椎间盘表型的观察 将杂交繁殖获得同窝的HIF-1α+/+小鼠和HIF-1α-/-小鼠,分为HIF-1α+/+小鼠2.5月龄组、HIF-1α-/-小鼠2.5月龄组、HIF-1α+/+小鼠4.5月龄组、HIF-1α-/-小鼠4.5月龄组,每组6只。在2.5、4.5月龄处死相应的小鼠,取L4-6腰椎,分别进行藏红固绿、HE及免疫组化相关指标染色及分析。 4益气化瘀方对HIF-1α基因敲除小鼠椎间盘软骨的影响 将0.5月龄HIF-1α基因敲除小鼠随机分为生理盐水组和益气化瘀方组,以生理盐水组小鼠作为正常对照,每组6只,共计12只小鼠。灌胃给药2月后,取各组小鼠的L4-6椎间盘,分别进行藏红固绿、HE及免疫组化相关指标染色及分析。 结果: 1HIF-1α基因敲除小鼠膝关节软骨表型的观察 Mankin评分显示HIF-1α-/-小鼠关节软骨破坏程度较HIF-1α+/+小鼠严重,HIF-1α-/-小鼠6月龄组较HIF-1α-/-小鼠4月龄组损伤严重,且具有显著性差异(P<0.01)。藏红固绿和HE染色显示,与同窝出生HIF-1α+/+小鼠相比,HIF-1α-/-小鼠4月龄组的膝关节软骨部位出现缺损和骨化,软骨表面形态不规则,软骨细胞排列不规则,软骨变薄,软骨细胞分布不均,软骨细胞总数减少。HIF-1α-/-小鼠6月龄组损伤更加严重,软骨组织的缺损加重,破损深达骨质辐射层,软骨细胞进一步减少,出现了成簇现象。免疫组化染色发现HIF-1α-/-小鼠4月龄组膝关节软骨中ColⅡ蛋白和Sox-9蛋白表达降低,ColX、MMP-13、VEGF蛋白表达增加。HIF-1α-/-小鼠6月龄组ColⅡ蛋白与Sox-9蛋白表达进一步降低,ColX、MMP-13、VEGF蛋白表达进一步上升。 2益气化瘀方对HIF-1α基因敲除小鼠膝关节软骨的影响 Mankin评分显示,与生理盐水组相比,益气化瘀方组膝关节损伤程度较小,且具有显著性差异(P<0.01)。HE染色和藏红固绿染色显示,与生理盐水组比较,益气化瘀方干预后膝关节软骨部位的骨化和缺损减轻,软骨细胞分布较均匀,细胞总数增加。免疫组化染色显示,益气化瘀方组ColⅡ和Sox-9蛋白的表达升高,ColX、VEGF、MMP-13蛋白表达减少。 3HIF-1α基因敲除小鼠椎间盘表型的观察 藏红固绿和HE染色显示HIF-1α-/-小鼠2.5月龄组椎间盘软骨组织出现溃疡和骨化,细胞分布不均匀,软骨细胞减少。HIF-1α-/-小鼠4.5月龄组椎间盘软骨损伤更加严重,软骨缺损增加,细胞进一步减少。免疫组化染色发现HIF-1α-/-小鼠2.5月龄组膝关节软骨中ColⅡ蛋白和Sox-9蛋白表达降低,ColX、MMP-13、VEGF蛋白表达增加。HIF-1α-/-小鼠4.5月龄组ColⅡ蛋白与Sox-9蛋白表达进一步降低,ColX、MMP-13、VEGF蛋白表达进一步上升。 4益气化瘀方对HIF-1α基因敲除小鼠椎间盘软骨的影响 与生理盐水组比较,益气化瘀方干预后HE染色和藏红固绿染色显示软骨骨化和缺损减轻,软骨细胞数目较多,分布较均匀。与生理盐水组相比,益气化瘀方组免疫组化染色显示ColⅡ和Sox-9蛋白的表达升高,ColX、VEGF、MMP-13蛋白表达减少。 结论:HIF-1α基因敲除小鼠的膝关节软骨出现了退变,并且小鼠膝关节软骨退变的程度随增龄逐渐加重;HIF-1α基因敲除小鼠出现了椎间盘软骨退变,并且这种退变随着小鼠增龄而加重;益气化瘀方可以延缓HIF-1α基因敲除小鼠的膝关节和椎间盘软骨退变。