研究目的: 1．观察rh—EGF在水凝胶基质中的释放模式。 2．检测rh—EGF在水凝胶基质中释放后的生物活性。 3．探讨含rh—EGF水凝胶对糖尿病大鼠伤口愈合的影响及可能的作用机理。 材料与方法: 1.构建含rh-EGF的水凝胶原料：rh-EGF、聚乙烯醇、海藻酸钠、甘油、苯甲酸钠、硼酸钠、氯化钙。合成技术：原位交联。物理性能检测：由合作单位中山大学高分子研究所完成。毒理实验：实验组其他成员完成。 2.rh-EGF在水凝胶基质中的释放模式及稳定性观察 3.rh-EGF在水凝胶基质中释放后的活性检测(细胞增殖MTT法)分别取上述实验2中1 d、7 d、14 d各12个时间点释放液0.4 ml加入3.6 ml含10﹪小牛血清的DMEM培养基中(含rh-EGFl～10 ng/ml)，用0.22 um滤器过滤后备用。各取200μl检测液加入已接种Balb/c3T3细胞的96孔板中，同时设阳性对照组(培养基中含rh-EGF标准品1～64 ng/ml，分别为1 ng/ml、4 ng/ml、16 ng/ml、64 ng/ml，每个浓度设3孔)和阴性对照组(培养基中不含rh-EGF)各12孔。于37℃5﹪CO<,2>环境下培养48小时。MTT法于492 nm波长处检测活性(用吸光度表示)。 4.建立糖尿病大鼠皮肤伤口模型56只250～300克清洁级SD大鼠，适应性饲养1周后，连续3 d腹腔内注射35 mg/kg STZ诱导糖尿病，注射3 d后尾静脉采血检测随机血糖水平，注射后随机血糖水平≥16.7 mmol/L，视为糖尿病模型建立成功。糖尿病大鼠实验期间自由进食、饮水，每周监测体重和血糖，根据血糖水平皮下注射低精蛋白胰岛素(NPH)1-2 U/d，血糖维持在16.7 mmol/L～28 mmol/L。 5.实验动物分组与创面用药实验动物按创面处理因素的不同分4大组，每组按不同处理时间再分为7天组和14天组(见表1)。空白对照组：不予处理；水凝胶基质组：每天外用水凝胶基质0.5g/每个创面；rh-EGF水凝胶组：每天外用rh-EGF水凝胶0.5 g/每个创面(含rh-EGF5μg)；rh-EGF水溶液组：每天外用rh-EGF水溶液0.5 ml/每个创面(含rh-EGF5μg)。 6.伤口愈合率评价分别在伤口形成后0 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d用数码相机进行伤口拍摄(A610，Canon)，同时放置一个有刻度直尺并标明大鼠的号码。伤口面积用Image J(1.36b版本)进行计算。 7.皮肤组织HE(Haematoxylin and eosin)染色及组织学评分组织取材后，经4﹪的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，行与头尾轴和皮肤表面垂直厚度4μm切片，切片经二甲苯脱蜡，然后进行浓度下行的梯度酒精直至蒸馏水。苏木素-伊红染色，自来水冲洗。常规脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。组织切片HE染色后，显微镜下观察以下指标并进行组织学评分：表皮和真皮的再生、肉芽组织厚度、新生血管形成，由一位病理科医生独立进行组织学评分。 8.皮肤组织中增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学检测采用SABC法染色。切片常规脱蜡水化后，加入过氧化酶阻断溶液阻断内源性过氧化物酶的活性，抗原修复后滴加5﹪BSA封闭非特异性反应，加入小鼠抗大鼠PCNA的第一抗体，4℃冰箱过夜(阴性对照用PBS替代一抗)后加入生物素标记的第二抗体，室温下孵育后再加入链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，DAB显色，脱水、透明、封片。染色过程中均设有阴性对照。免疫组化染色结果按照IRS标准进行评分。 9.皮肤组织中抗凋亡蛋白(BCL-2)免疫组织化学检测采用SABC法染色。切片常规脱蜡水化后，加入过氧化酶阻断溶液阻断内源性过氧化物酶的活性，抗原修复后滴加5﹪BSA封闭非特异性反应，加入兔抗大鼠BCL-2的第一抗体，4℃冰箱过夜(阴性对照用PBS替代一抗)后加入生物素标记的第二抗体，室温下孵育后再加入链霉菌抗生物素蛋白.过氧化物酶溶液，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。染色过程中均设有阴性对照。免疫组化染色结果按照IRS标准进行评分。 10.皮肤组织中表皮生长因子受体(EGFR)蛋白质水平的Western blot检测提取皮肤组织中总蛋白质，用MiniBCA法测定蛋白浓度，再通过蛋白质印迹法(Western blot)来测定EGFR的蛋白质水平，以β-actin作为内参照。在暗室中用X光胶片曝光。用BandScan4.3软件对条带进行灰度扫描，以总灰度代表EGFR蛋白的表达量，以目的蛋白与β-actin的比值代表目的蛋白相对水平。 11.统计学分析实验数据采用SPSS13.0统计学软件进行分析。计量资料符合正态分布者用均数±标准差表示，重复测量资料多组间比较采用多元方差分析，非重复测量资料多组间比较采用单因素方差分析，非正态数据采用Wilcoxon秩和检验，检验水平α值定为0.05. 实验结果: 1.rh-EGF在水凝胶基质中的释放模式及稳定性观察试验期间，rh-EGF水凝胶在不同温度、不同储存时间下外观、性质、气味、pH值均无明显变化。 2.rh-EGF在水凝胶基质中释放后的活性检测:实验组、阳性对照组、阴性对照组的平均活性(吸光度)分别为0.90±0.10、0.86±0.10、0.80±0.14、0.87±0.15、0.55±0.10。实验组和阳性对照组促BALB/c3T3增殖的活性均高于阴性对照组(p<0.05)，实验组和阳性对照组间差异无统计学意义。 3.糖尿病大鼠伤口模型的建立SD大鼠腹腔注射STZ 3 d后，各个时间点随机血糖均高于16.7 mmol/L，范围波动于17～28 mmol/L。成模后体重均明显下降。从血糖和体重随时间变化的趋势看，空白对照组、水凝胶基质组、含rh-EGF水凝胶组、含rh-EGF水溶液组4组组间血糖值、体重值差异无统计学意义。实验期间血糖和体重对伤口愈合的影响在各组间取得均衡。 4.伤口愈合率比较从伤口愈合率随时间变化的趋势看，4组愈合率的差别具有统计学意义(p<0.05)。含rh-EGF水凝胶组在各个时间点愈合率均最高。伤口形成后第3 d、5 d水凝胶处理组(B、C)愈合率高于空白对照组(p<0.05)；第10 d水凝胶处理组(B、C)优于非水凝胶处理组(A、D)(p<0.05)；第14 d三个治疗组均优于空白对照组(p<0.05)，而三个治疗组间差异无统计学意义。 5.4组伤口组织病理学比较在新生血管形成评分中，伤口形成后第7 d rh-EGF处理组(C、D)高于非rh-EGF处理组(A、B)(p<0.05)，提示rh-EGF具有促进新生血管形成的作用。在再上皮化评分中，水凝胶处理组(B、C)高于非水凝胶处理组(A、D)，14 d时趋势明显(p<0.05)，提示水凝胶基质可促进再上皮化。在上述评分中，rh-EGF 水凝胶组评分最高，提示rh-EGF和水凝胶基质协同加速新生血管形成和再上皮化。肉芽组织厚度评分中，伤口形成后第7 d时rh-EGF水凝胶组略高于其它三组，组间差异暂未达到统计学意义。 6.不同时间4组PCNA蛋白表达水平的比较PCNA蛋白主要在增生活跃的表皮细胞、毛囊上皮、血管内皮细胞、成纤维细胞的胞核表达，表达水平7 d>14 d>0 d。从其随时间变化的趋势看，各组问的区别具有统计学意义。0d时空白对照组、水凝胶基质组、含rh-EGF水凝胶组、含rh-EGF水溶液组组问差异无统计学意义。伤口形成后第7 d各组表达水平分别为9.69±0.93、10.80±1.25、11.49±1.12、10.71±1.27：rh-EGF水凝胶组高于空白对照组(p<0.05)。第14 d各组间差异无统计学意义。结果提示rh-EGF水凝胶在伤口愈合的早中期促进细胞增殖。 7.结果提示rh-EGF在伤口愈合的早中期可能具有上调BCL-2蛋白表达的作用，rh-EGF水凝胶可能对凋亡途径产生一定的影响，从而影响伤口愈合。 8.不同时间4组间EGFR蛋白表达水平的比较从EGFR蛋白表达水平随时间变化的趋势看，结果提示rh-EGF在伤口愈合的早中期具有上调EGFR蛋白表达作用。EGFR蛋白表达水平的变化规律与PCNA、BCL-2的变化规律相近，提示EGFR在伤口愈合过程中可能同时参与细胞增殖和细胞凋亡的调节。 结论: 1.本研究构建的含rh-EGF水凝胶具有储存稳定性。水凝胶基质对rh-EGF有缓释和保持生物活性作用。 2.水凝胶基质、含rh-EGF的水凝胶能促进糖尿病大鼠伤口愈合。 3.含rh-EGF的水凝胶促进伤口愈合的可能机制为：水凝胶基质保护创面、促进再上皮化；rh-EGF在伤口形成后的早中期上调内源性EGFR表达，促进细胞增殖、迁移、分化，促进肉芽形成；rh-EGF上调抗凋亡BCL-2蛋白表达，抑制细胞凋亡；EGFR在伤口修复过程中可能起多向性作用，同时参与了细胞增殖和细胞凋亡的调节，从而影响伤口愈合。