研究背景：牙根外吸收是在临床上比较常见的现象,导致外吸收最常见的原因是创伤,其次为感染、再植牙、肿瘤或阻生牙压迫等。进行性的牙根外吸收可导致牙髓坏死、牙齿松动甚至脱落。但迄今人们尚不清楚其真正的发生机制,从而难以对牙根吸收的发生发展做出准确的预测,加之尚无有效的预防及治疗方法,这就使口腔临床医生面对牙根吸收感到束手无策。因此,牙根吸收成为口腔临床一大难题之一,越来越为国内外口腔医学界的学者们所关注,相关研究报道也日益增多。笔者查阅近几年的相关文献发现,无论是基础研究还是临床研究,均未取得突破性的进展。牙根吸收的机制仍未阐明,临床上牙根吸收的治疗仍无明显成效。然而,令我们感兴趣的是,有研究报道,当去除导致牙根吸收或缺损的创伤因素后,牙根吸收可很快停止,缺损部位修复被激活,一段时间后,在牙根表面有新的牙骨质沉积和新的牙周膜附着的形成,这些表明牙根具有高度的自我修复潜能。因此,我们设想,能否以牙根自然修复为切入点进行一系列研究,从而为牙根吸收的治疗提供线索或有意义的启示呢?带着这一问题,我们查阅了相关文献,发现有关牙根自然修复的研究尚停留于组织学层面,有关新生牙骨质的来源及类型、牙骨质最初沉积的部位及有无新的牙周膜附着形成,均报道不一,尚需严谨的实验设计去论证。通过分析发现,以往研究所建立的动物模型多采用正畸加力方式导致牙根吸收,然后停止加力观察牙根有无修复,但因加力方式易受外界因素的干扰、力值衰减以及牙根吸收具有部位及程度的不可控性等因素的影响,所建立的动物模型具有不稳定性及难以重复性。因此,能否建立稳定、可靠的牙根修复动物模型将对探讨牙根自然修复发生的生物学机制具有重要意义。近年来,微螺钉种植体(mini-screw implant, MSI)作为绝对支抗的重要手段之一,因其简便、创伤小、效果确切等特点,逐渐受到广大口腔正畸医生的重视和青睐,临床医生在使用时都极力避免触及或损伤邻近牙根,以降低牙根吸收这一主要并发症的发生率。然而,基于本研究的目的,本课题则是借助MSI有目的地损伤Beagle犬后牙牙根,并观察其自然修复的情况,以此建立稳定、可靠的牙根损伤修复动物模型,并在此基础上对牙根修复机制作初步探讨。目的：1.对Beagle犬后牙行影像学测量研究,为MSI在Beagle犬后牙根分叉区的植入定位提供参考数据；2.建立稳定、可靠的牙根损伤修复动物模型,为牙根修复机制的研究提供动物模型条件；3.对Beagle犬牙根损伤后自然修复早期进行组织学观察,初步探讨牙根的自然修复机制；4.利用荧光双标记Beagle犬牙根损伤后自然修复的过程,探讨牙根的自然修复机制；方法：1.实验动物选择健康成年Beagle犬5只,2雄3雌,犬龄20-22个月,体重12-16 kg。Beagle犬的齿式为2(I3/3,C1/1,Pm4/4,M2/3),全口共42颗牙。2.影像学测量选取每只犬的上下颌第二、第三、第四前磨牙(Pm2、Pm3、Pm4)及下颌第一磨牙(M1),共70颗牙作为研究对象。各实验犬全麻后行CBCT扫描,利用NNTViewer软件对上述牙位行相关的影像学测量。测量方法：首先描记出各牙齿牙体长轴,取与牙体长轴垂直的牙冠最大近远中径AB并测量,过最大牙尖的顶点C作与AB垂直且等长的线段CD(D点拟作为MSI植入定位的参照点),分别测量D点至近中根、远中根、根分叉的的距离Dm、Dd、Df。3.MSI植入部位选取上颌第二、第三前磨牙和下颌第二、第三、第四前磨牙及下颌第一磨牙的近中根,上颌第一前磨牙的远中根面(该牙为单根牙)和上颌第四前磨牙的远中根作为MSI损伤的对象。除上颌第一前磨牙外,其他牙位均在根分叉区偏根方靠近欲损伤牙根根面植入。在各牙位根分叉区选取参照点D,据Dm、Dd值估测牙根的位置。在手术植入MSI时,还应结合阻力大小进行植入。4.实验设计选取其中4只Beagle犬,2雄2雌,每只实验犬均选取上颌第一、第二、第三、第四前磨牙和下颌第二、第三、第四前磨牙及下颌第一磨牙作为实验观察对象,共64个位点。实验分8周、6周、4周、3周、2周、1周、3天、0天共8个时间点进行观察,分别在处死前8周、6周、4周、3周、2周、1周、3天、0天选取8个位点进行手术建模,即第一次手术(适应性饲养一周后)的8个位点纳入8周时间点,第二次手术纳入6周时间点,后以此类推。4只实验犬均于第一次手术后的8周处死,按牙位切取标本,EDTA脱钙8-10周,常规制备石蜡切片,HE染色,行组织形态学观察。另一只Beagle犬,选取上颌第二、第三、第四前磨牙和下颌第二、第三、第四前磨牙及下颌第一磨牙作为实验观察对象,共14个位点。行手术建模,于术后4周颈部皮下注射四环素,术后8周颈部皮下注射钙黄绿素,术后12周处死。按牙位切取标本,制备骨磨片,荧光显微镜下观察。制作硬组织切片,亚甲基蓝-酸性品红染色,行组织形态学观察。5.手术过程及动物模型建立实验犬以30 g/L(3%)戊巴比妥钠按1 mL/kg肌肉注射行全身麻醉后,术区以2%普鲁卡因/肾上腺素(1：100000)浸润麻醉。每只实验犬在预先设计的植入部位垂直于牙长轴植入微螺钉种植体约10mm,并立即旋出。术后1-3 d给予肌肉注射青霉素(80万u/d)预防感染。术后拍摄CT,并定期观察伤口愈合情况。按预定时间处死实验动物后,分别制作石蜡切片及硬组织切片,行组织形态学观察。结果：1.实验所用Beagle犬左右侧同名牙Dm、Dd、Df值差异均无统计学意义(P>0.05)；Dd值与Dm值基本相等；Df值均大于3.9 mm。MSI以D点为参照点向近远中移动一定的距离(Dm或Dd减去MSI直径的一半)即可触及牙根。2.所有位点术后伤口均愈合良好,牙根有效损伤率达73.4%,组织学观察可见损伤的牙根面有新生牙骨质的形成及牙周膜附着,牙根损伤修复动物模型成功建立。3.石蜡组织切片观察发现：术后当天,缺损区见大量的血凝块以及牙根或骨组织碎片。术后3天,缺损区见大量的血细胞浸润和较多的血浆渗出物,亦可见较多的炎症细胞聚集。术后1周,缺损区见大量的成纤维细胞及血管内皮细胞,可见稀疏的交织成网状的新生胶原纤维。术后2周,缺损区见大量的结缔组织及新生骨样组织,缺损牙根面见类成牙骨质细胞及新生牙周膜纤维的附着,已有牙骨质修复的迹象。术后3周,缺损区充满新生的牙骨质、牙周膜及骨组织,三种新生组织分界明显；缺损牙根面见明显的新生牙骨质,为细胞牙骨质,新生的牙周膜纤维附着其中,新生骨组织区生长、改建活跃。术后4周,缺损区新生结缔组织胶原化明显,新生牙骨质和骨组织进一步矿化。术后6周,缺损区充满新生的牙骨质、牙周膜及骨组织,三种新生组织分界明显,可见新生骨组织凸向并占据部分根缺损区,牙周膜宽度变窄,缺损牙根面新生牙骨质的量有增多趋势且逐渐矿化,牙骨质细胞明显减少；新生的牙周膜纤维斜向附着于新生的牙骨质和新生骨内,呈功能性排列。术后8周,缺损区新生的牙骨质、牙周膜及骨组织分界明显；缺损牙根面新生牙骨质的量有增多趋势且逐渐矿化,牙骨质细胞明显减少；新生牙周膜胶原化明显,附着于新生牙骨质和新生骨内,呈功能性排列,其宽度进一步变窄；新生骨组织进一步矿化,并可见新生骨组织凸向并占据部分根缺损区。4.不脱钙组织切片观察发现,术后12周,缺损区见新生的牙骨质、牙周膜和牙槽骨；牙根面缺损底部牙骨质的厚度大于周边；新生的牙周膜与邻近缺损部位的正常牙周膜相连续,且其宽度已接近正常牙周膜宽度；新生牙槽骨与周围正常牙槽骨组织学上未见明显差异,提示骨改建已基本完成。5.荧光磨片观察发现,靠近新生牙周膜的牙根侧及牙槽骨侧均见清晰的绿色荧光条带和黄色荧光条带,绿色荧光条带邻近牙周膜两侧,黄色荧光条带在绿色荧光条带的外围,提示在修复过程中新生牙周膜的宽度逐渐变窄。新生骨组织区靠近牙周膜的荧光条带呈与牙根缺损外形一致的圆弧形排列,而位于牙槽骨内的大部分可见较多类似于同心圆排列的荧光条带,提示缺损部位的新生骨可能有两种不同的细胞来源。研究结果均未发现根骨粘连的现象。结论：1.本研究借助微螺钉种植体损伤牙根并观察其自然修复,以此成功建立了牙根损伤修复动物模型；该模型稳定、可复制性强,制备方法简单、易行,可充分满足研究牙根修复机制的需要。2.本研究结果显示,牙根损伤后2周,损伤根面已有类成牙骨质细胞的附着,即有类牙骨质修复的迹象；2-3周,缺损牙根面逐渐有新生的细胞牙骨质沉积,且有新生的牙周膜纤维附着；牙骨质在缺损根面最初沉积的部位并无特异性,可发生于缺损根面任意部位；其中成牙骨质细胞可能由牙周膜细胞分化而来,尚需进一步论证。3.本研究牙根损伤修复过程中,通过局部环境的诱导和损伤区未分化间充质细胞的定向迁移,牙周膜细胞总能率先占据牙根缺损区,实现牙骨质、牙周膜和牙槽骨的新生。新生牙周膜两侧不断有新生的牙骨质和骨组织形成,且牙周膜宽度逐渐变窄,12周时已接近正常牙周膜的宽度。4.在牙根损伤修复过程中,缺损部位的新生骨可能有两种不同的细胞来源：靠近牙周膜的新生骨(荧光条带呈弧形排列)可能由牙周膜来源的成骨细胞所形成,而缺损区位于牙槽骨内的大部分新生骨组织(荧光条带呈同心圆排列)可能由骨髓来源的成骨细胞所形成。本研究中的成骨过程是一种较完整的膜内成骨方式。