论文部分内容阅读
背景:肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是癌症的第三号杀手。尽管目前诊疗手段日新月异,但HCC进展迅速,患者往往在确诊后约6个月死亡。因此我们需要寻找一种更有效的治疗方法,而基因治疗的兴起,为从根本上彻底治疗该病带来了希望。我国HCC患者血清乙肝病毒表面抗原阳性率逾90%。研究发现,80%以上HCC患者的肝组织中含有特异性的HBx蛋白,并有充分的实验依据说明HBx蛋白与HCC的发生与发展关系甚为密切,因此HBx基因可能为HCC基因治疗的理想靶基因。ENA干扰是在双链RNA介导下特异性转录后基因沉默。大量研究表明RNAi现象不仅是一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段,而且有可能在基因功能测定、基因治疗等方面提供新的方法。研究围绕“沉默HBx基因表达治疗HCC研究”进行。目的:RNAi沉默HBx基因表达治疗肝细胞癌。方法:以人肝癌细胞株MHCC97-H细胞gDNA为模板,PCR克隆HBx基因片段,测序和Blast分析;通过HBx全基因扩增,初步研究HBx基因3’末端与HBV DNA整合位点之间的关系;设立严格对照,用RT-PCR和细胞免疫荧光染色分析MHCC97-H细胞内HBx基因转录及HBx蛋白表达。按shRNA设计原则,依据从MHCC97-H中克隆HBx基因序列,设计并合成编码shRNA三对寡核酸序列(含无关对照序列),经退火成互补双链,克隆至PGenesil-I载体;行酶切、PCR和测序鉴定;将鉴定的shRNA质粒脂质体转染MHCC97-H细胞,观察EGFP表达,流式细胞分析转染效率。电穿孔转染将三种构建的质粒导入MHCC97-H细胞;G418筛选、挑单细胞克隆;用半定量RT-PCR及细胞免疫荧光分析单细胞克隆中靶向shRNA对HBx基因mRNA及细胞内HBx蛋白水平的影响。对HBx表达下调的单细胞克隆,体外实验分析细胞周期、细胞增殖;裸鼠体内单细胞克隆成瘤情况;并对成瘤组织行病理分析。结果:在MHCC97-H细胞中克隆、测序获247bpHBx基因片段,Blast分析证实整合的HBx基因为adr亚型(C基因型);HBx全基因扩增失败,推测HBV DNA整合位点可能位于HBx基因3’末端,导致整合HBx基因3’末端缺失;MHCC97-H细胞整合HBx基因转录mRNA并表达HBx蛋白。酶切、PCR及测序证实pshRNA-X164/X215/MOCK载体构建成功;转染48h后MHCC97-H细胞发出绿色荧光,pshRNA-X215转染效率最低。经过30-35天筛选,pshRNA-X215/X164/MOCK质粒转染后分别挑取了109个、184、60个单细胞克隆;半定量RT-PCR分析:与MHCC97H比较,MOCK各单细胞克隆HBx mRNA水平变化不明显;与MOCK02克隆比较,X215有6个克隆有HBx mRNA水平的下调约为70-93%,X164各克隆下调≤25%;与MOCK02克隆比较,21543克隆胞内HBx蛋白水平下降;细胞周期检测,21543比MOCK02克隆:G0/G1期:86.93±1.00%VS 65.97±2.43%,S期:7.39±0.97%VS 19.53±2.23%(P＜0.05);平板克隆形成率,MOCK02:21.6±2.9%,21543:19.1±2.5%(P＞0.05);裸鼠异位移植肿瘤生长体积MOCK02:766.6±117.8mm~3,21543∶255.3±66.1mm~3(P＜0.05);原位移植肿瘤的几何平均直径MOCK02∶1.07±0.13cm,21543∶0.51±0.08cm(P＜0.05);HE染色示21543和MOCK02克隆肿瘤组织病理结构差别不明显;免疫组织化学染色21543和MOCK02克隆HBsAg、HBcAg阴性,AFP阳性。结论:MHCC97-H细胞是选择性表达HBx基因的人肝癌细胞株。构建了靶向整合于人肝癌MHCC97-H细胞HBx基因特异性shRNA表达质粒,并成功转染人肝癌细胞MHCC97-H。RNAi沉默MHCC97-H细胞HBx基因表达能明显延缓MHCC97-H细胞生长,对HCC有一定的治疗作用;表明HBx基因在维持肝癌肿瘤细胞生长中起重要作用。